Brug af primære kulturperler Hippocampal Neuroner til at studere forsamlingen af Axon indledende segmenter
Summary
Her beskrev vi en protokol til kvantitativt at studere samlingen og strukturen af axon indledende segmenter (AIS) af hippocampal neuroner, der mangler formonteret AIS på grund af fraværet af en kæmpe ankyrin-G.
Abstract
Neuronal axon indledende segmenter (AIS) er steder for indledning af handling potentialer og er blevet grundigt undersøgt for deres molekylære struktur, samling og aktivitet-afhængige plasticitet. Giant ankyrin-G, master arrangør af AIS, direkte forbinder med membran-spænder spænding gated natrium (VSVG) og kalium kanaler (KCNQ2/3), samt 186 kDa neurofascin, en L1CAM celle vedhæftning molekyle. Giant ankyrin-G binder sig også til og rekrutterer cytoplasmiske AIS molekyler, herunder beta-4-spectrin, og mikrotubule-bindende proteiner, EB1/EB3 og Ndel1. Giant ankyrin-G er tilstrækkelig til at redde AIS dannelse i ankyrin-G mangelfuld neuroner. Ankyrin-G indeholder også en mindre 190 kDa isoform placeret ved dendritiske rygsøjler i stedet for AIS, som er ude af stand til at målrette mod AIS eller redde AIS i ankyrin-G-mangelfuld neuroner. Her beskrev vi en protokol ved hjælp af dyrkede hippocampale neuroner fra ANK3-E22/23-flox mus, som, når de transfected med Cre-BFP udviser tab af alle isoform af ankyrin-G og forringe dannelsen af AIS. Kombineret en modificeret Banker glia / neuron co-kultur system, vi udviklet en metode til at transfekt ankyrin-G null neuroner med en 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, hvilket er tilstrækkeligt til at redde dannelsen af AIS. Vi anvender desuden en kvantificeringsmetode, udviklet af Salzer og kolleger til at håndtere variation i AIS afstand fra de neuronale cellelegemer, der forekommer i hippocampale neuronkulturer. Denne protokol tillader kvantitative undersøgelser af de novo-samlingen og AIS’s dynamiske adfærd.
Introduction
Axon indledende segment er placeret på den proksimale axon i de fleste hvirveldyr neuroner. Funktionelt er AIS, hvor handlingspotentialer indledes på grund af den høje tæthed af spændings-gated natriumkanaler i denne region. AIS af nogle excitatoriske neuroner er også målrettet mod hæmmende interneuroner ved at danne GABAergic synapser1,2,3. Derfor er AIS et kritisk sted at integrere cellesignalering og modulere neuronernes excitabilitet. AIS er normalt 20-60 μm i længden og placeret inden for 20 μm af cellekroppen. Længden og placeringen af AIS varierer i neuroner på tværs af hjerneregioner såvel som i forskellige udviklingsstadier af samme neuron4,5. Akkumuleret dokumentation tyder på , at AIS’ sammensætning og position er dynamisk til at reagere på ændringen af neuronal aktivitet4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G er hovedarrangør af AIS. 480 kDa ankyrin-G er et membran associeret adapterprotein, der direkte binder sig til spændingsporterede natriumkanaler samt andre større AIS-proteiner, herunder beta4-spectrin, KCNQ2/3-kanaler, der modulerer natriumkanalaktivitet8,9og 186 kDa neurofascin, et L1CAM, der dirigerer GABAergic synapser til AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G aksjer kanoniske ankyrin domæner findes i den korte 190 kDa ankyrin-G isoform (ANK gentager, spectrin bindende domæne, regulerende domæne), men er kendetegnet ved en kæmpe exon, der findes kun i hvirveldyr og er specifikt udtrykt i neuroner (Figur 1A)11,12. Det 480 kDa ankyrin-G neuron specifikke domæne (NSD) er påkrævet for AISformation 12. Den 190 kDa ankyrin-G fremmer ikke AIS forsamling eller mål AIS i ankyrin-G-null neuroner12. 190 kDa ankyrin-G er dog koncentreret på AIS, der indeholder 480 kDa ankyrin-G12. Denne evne til 190 kDa ankyrin-G til at målrette formonteret AIS af wildtype neuroner har været en kilde til forvirring i litteraturen og har bremset forståelsen af de kritiske specialiserede funktioner i 480 kDa ankyrin-G i AIS forsamling. Derfor er det vigtigt at studere AIS-samling i ankyrin-G-null neuroner, der mangler en formonteret AIS.
Her præsenterer vi en metode til at studere AIS’s samling og struktur ved hjælp af dyrkede hippocampale neuroner fra ANK3-E22/23-flox mus, der eliminerer alle isoformer af ankyrin-G13 (Figur 1B). Ved at transfektere neuroner med en Cre-BFP-konstruktion, før AIS samles, genererede vi ankyrin-G-mangelfulde neuroner, der helt manglede en AIS (Figur 1B, Figur 2). Samlingen af AIS er fuldt reddet efter co-transfection af 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid med en Cre-BFP plasmid. Denne metode gør det at studere AIS-samlingen i et ikke-formonteret AIS-miljø. Vi har også ændret glia-neuron co-kultur system fra Gary Banker uden at bruge antibiotika, tidligere designet til embryonale dag 18 neuroner, til anvendelse til postnatal mus neuroner og tilpasset en AIS quantitation metode til gennemsnitlige AIS målinger fra flere neuroner til at normalisere variationen af AIS14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Samlingen af AIS er organiseret af 480 kDa ankyrin-G. Ankyrin-G har dog kortere isoformer, der kan målrettes mod AIS af wildtype neuroner, hvilket kan føre til vanskeligheder med fortolkning af strukturfunktionsanalyser af AIS-samling. Her præsenterer vi en metode ved hjælp af neuroner fra ANK3-E22/23-flox mus, der gør det muligt at studere de novo samling af AIS. Ved at transfectere med Cre-BFP ved 3 div eliminerer vi alle endogene isoformer af ankyrin-G. Vi kunne også co-transfect 480 kDa ankyri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Gary Banker for forslag om neuronal kultur protokol. Dette arbejde er støttet af Howard Hughes Medical Institute, et tilskud fra NIH, og en George Barth Geller begavet professorat (V.B.).
Materials
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
References
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for “anchorin”: Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
