Summary

Uso de neurônios hipocampais primários para estudar a montagem de segmentos iniciais de Axon

Published: February 12, 2021
doi:

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo para estudar quantitativamente a montagem e estrutura dos segmentos iniciais de axônio (AIS) de neurônios hipocampais que carecem de AIS pré-montada devido à ausência de um anquilírin-G gigante.

Abstract

Os segmentos iniciais do axônio neuronal (AIS) são locais de iniciação de potenciais de ação e têm sido extensivamente estudados para sua estrutura molecular, montagem e plasticidade dependente da atividade. Ankyrin-G gigante, o principal organizador do AIS, associa-se diretamente com os canais de adesão de tensão de tensão de membrana (VSVG) e canais de potássio (KCNQ2/3), bem como neurofascina de 186 kDa, uma molécula de adesão celular L1CAM. Ankyrin-G gigante também se liga e recruta moléculas citoplasmáticas de AIS, incluindo beta-4-spectrin, e as proteínas de ligação de microtúbulos, EB1/EB3 e Ndel1. Anquilo-G gigante é suficiente para resgatar a formação de AIS em neurônios deficientes de ankyrin-G. Ankyrin-G também inclui um isoform menor de 190 kDa localizado em espinhos dendráticos em vez da AIS, que é incapaz de atingir a AIS ou resgatar o AIS em neurônios deficientes de ankyrin-G. Aqui, descrevemos um protocolo usando neurônios hipocampais cultivados de camundongos ANK3-E22/23-flox, que, quando transfectados com Cre-BFP exibem perda de toda a isóforme de ankyrina-G e prejudicam a formação de AIS. Combinado um sistema de co-cultura Banker glia/neuron modificado, desenvolvemos um método para transfetar neurônios anquilino-G nulos com um plasmídeo ankyrin-G-GFP de 480 kDa, o que é suficiente para resgatar a formação de AIS. Utilizamos ainda um método de quantificação, desenvolvido por Salzer e colegas para lidar com a variação da distância AIS dos corpos de células neuronais que ocorre nas culturas de neurônios hipocampais. Este protocolo permite estudos quantitativos da montagem de novo e comportamento dinâmico da AIS.

Introduction

O segmento inicial do axônio está localizado no axônio proximal na maioria dos neurônios vertebrados. Funcionalmente, a AIS é onde os potenciais de ação são iniciados devido à alta densidade de canais de sódio fechados por tensão nesta região. AIS de alguns neurônios excitatórios também são alvo de interneurônios inibitórios através da formação de sinapses GABAérgicas1,2,3. Portanto, a AIS é um local crítico para integrar a sinalização celular e modular a excitabilidade dos neurônios. A IS tem normalmente 20-60 μm de comprimento e está localizada dentro de 20 μm do corpo celular. O comprimento e a posição da AIS variam em neurônios entre regiões cerebrais, bem como em diferentes estágios de desenvolvimento do mesmo neurônio4,5. Evidências acumuladas sugerem que a composição e a posição da AIS são dinâmicas na resposta à mudança da atividade neuronal4,5,6,7.

480 kDa ankyrin-G é o principal organizador da AIS. 480 kDa ankyrin-G é uma proteína adaptadora associada à membrana que se liga diretamente aos canais de sódio fechados de tensão, bem como outras proteínas AIS importantes, incluindo beta4-spectrina, KCNQ2/3 canais que modulam a atividade do canal de sódio8,9e 186 kDa neurofascina, uma L1CAM que direciona as sínteses GABAergic para o AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G compartilha domínios de ankyrina canônica encontrados na pequena isoforma ankyrin-G de 190 kDa (se repete ANK, domínio vinculante de espectros, domínio regulatório), mas são distinguidos por uma exon gigante que é encontrada apenas em vertebrados e é expressa especificamente em neurônios(Figura 1A)11,12. O domínio específico do neurônio ankyrin-G de 480 kDa (NSD) é necessário para a formação AIS12. O ankyrin-G de 190 kDa não promove a montagem AIS ou o alvo AIS em neurônios ankyrin-G-null12. No entanto, 190 kDa ankyrin-G está concentrado na AIS contendo 480 kDa ankyrin-G12. Esta habilidade do ankyrin-G de 190 kDa para atingir a AIS pré-montada de neurônios do tipo selvagem tem sido uma fonte de confusão na literatura e retardou a apreciação das funções especializadas críticas do ankyrin-G de 480 kDa na montagem AIS. Portanto, é fundamental estudar a montagem da AIS em neurônios anquilo-G-nulos que carecem de uma AIS pré-montada.

Aqui, apresentamos um método para estudar a montagem e estrutura do AIS utilizando neurônios hipocampais cultivados de camundongos ANK3-E22/23-flox que elimina todas as isoformas de ankyrin-G13 (Figura 1B). Ao transfetar neurônios com uma construção Cre-BFP antes da AIS ser montada, geramos neurônios deficientes ankyrin-G completamente sem uma AIS (Figura 1B, Figura 2). A montagem da AIS é totalmente resgatada após a co-transfecção de 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid com um plasmídeo Cre-BFP. Este método fornece uma maneira de estudar a montagem AIS em um ambiente AIS não pré-montado. Também modificamos o sistema de cocultura glia-neurônio de Gary Banker sem o uso de antibióticos, previamente projetado para o dia 18 neurônios embrionários, para aplicação aos neurônios do camundongo pós-natal e adaptamos um método de quantitação AIS para medições médias de AIS de múltiplos neurônios para normalizar a variação de AIS14,15.

Protocol

NOTA: Este método de cultura de neurônios hipocampais de camundongos pós-natal ank3-E22/23f/f é adaptado do sistema de cocultura glia/neurônio de Gary Banker. Por isso, é fundamental realizar todas as etapas após a dissecção em um capô limpo usando ferramentas esterilizadas. Este protocolo leva até 1 mês. O fluxo de trabalho é exibido na Figura 3. O protocolo segue as diretrizes animais da Universidade Duke. 1. Preparação de tampas…

Representative Results

Um conjunto completo de experimentos deve incluir apenas a transfecção cre-BFP como controle negativo, Cre-BFP mais 480 kDa co-transfecção ankyrin-G como controle positivo e uma condição não transfectada como controle técnico. No controle somente do Cre-BFP, os neurônios transfectados não possuem o acúmulo de marcadores AIS, incluindo ankyrin-G (ankG), beta4-spectrin (β4), neurofascina (Nf) e canais de sódio fechados de tensão (VSVG)(Figura 4A)16. Em con…

Discussion

A montagem da AIS é organizada por 480 kDa ankyrin-G. No entanto, ankyrin-G tem isóformes mais curtos que podem atingir a AIS de neurônios tipo selvagem, o que pode levar à dificuldade de interpretação das análises estrutura-função do conjunto AIS. Aqui apresentamos um método utilizando neurônios de camundongos ANK3-E22/23-flox que permite o estudo da montagem de novo da AIS. Transfeciando com Cre-BFP em 3 div, eliminamos todas as isoformas endógenas de ankyrin-G. Também poderíamos co-tran…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Gary Banker por sugestão sobre o protocolo de cultura neuronal. Este trabalho é apoiado pelo Howard Hughes Medical Institute, uma bolsa do NIH, e um professor dotado de George Barth Geller (V.B.).

Materials

10xHBSS Thermo Fisher Scientific 14065-056
18mm coverglass (1.5D) Fisher Scientific 12-545-84-1D
190kDa ankyrin-G-GFP Addgene #31059
2.5% Tripsin without phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
480kDa ankyrin-G-GFP lab made Provide upon request
ANK3-E22/23f/f mice JAX Stock No: 029797 B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;
B27 serum-free supplement Thermo Fisher Scientific A3582801
Boric acid Sigma-Aldrich B6768
Cell strainer with 70-mm mesh BD Biosciences 352350
Ceramic coverslip-staining rack Thomas Scientific 8542E40
Cre-BFP Addgene #128174
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995073
GlutaMAX-I supplement Thermo Fisher Scientific A1286001
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668030
MEM with Earle’s salts and L-glutamine Thermo Fisher Scientific 11095-080
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103-049
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 225711
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985062
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Poly-L-lysine hydrochloride Sigma-Aldrich 26124-78-7
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 1310-58-3

References

  1. Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
  2. Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
  3. Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
  4. Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
  5. Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
  6. Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
  7. Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
  8. Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
  9. Cooper, E. C. Made for “anchorin”: Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
  10. Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
  11. Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
  12. Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
  13. Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  15. Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
  16. Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).

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Cite This Article
Yang, R., Bennett, V. Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments. J. Vis. Exp. (168), e61411, doi:10.3791/61411 (2021).

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