अलगाव और चिक सिलियरी गैंगलियन न्यूरॉन्स की संस्कृति
Summary
चिक सिलियरी गैंगलिया (सीजी) पैरासिम्पेथेटिक नर्वस सिस्टम का हिस्सा हैं। लड़की सीजी न्यूरॉन्स की न्यूरोनल संस्कृतियों तंत्रिका मांसपेशी बातचीत के अध्ययन में प्रभावी सेल मॉडल होने के लिए दिखाया गया था। हम विच्छेदन, वियोजन और लड़की भ्रूण से सीजी न्यूरॉन्स की इन विट्रो संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
चिक सिलियरी गैंगलिया (सीजी) परायपैथिक तंत्रिका तंत्र का हिस्सा हैं और आंखों में मौजूद मांसपेशियों के ऊतकों के आंतरिककरण के लिए जिम्मेदार हैं। यह गैंगलियन सिलियरी और कोरॉयडल न्यूरॉन्स की एक समरूप आबादी द्वारा गठित किया जाता है जो क्रमशः आंतरिक और चिकनी मांसपेशी फाइबर होता है। इनमें से प्रत्येक न्यूरोनल प्रकार विशिष्ट नेत्र संरचनाओं और कार्यों को विनियमित करता है। इन वर्षों में, चिक सिलियरी गैंगलिया की न्यूरोनल संस्कृतियों को मांसपेशियों-तंत्रिका तंत्र बातचीत के अध्ययन में प्रभावी सेल मॉडल दिखाया गया था, जो कोलिनेर्गिक सिनेप्स के माध्यम से संवाद करते हैं। सिलियरी गैंगलियन न्यूरॉन्स, इसके बहुमत में, कोलिनेर्गिक हैं। इस सेल मॉडल को पहले इस्तेमाल किए गए विषम कोशिका मॉडल के लिए तुलनात्मक रूप से उपयोगी दिखाया गया है जिसमें कोलिनेर्गिक के अलावा कई न्यूरोनल प्रकार शामिल हैं। शारीरिक रूप से, सिलियरी गैंगलियन ऑप्टिक नर्व (ऑन) और कोरॉइड फिशर (सीएफ) के बीच स्थानीयकृत है। यहां, हम चिक भ्रूण से सिलियरी गैंगलिया न्यूरॉन्स के विच्छेदन, वियोजन और इन विट्रो संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। हम सीजी न्यूरॉन्स की अत्यधिक शुद्ध और स्थिर सेलुलर संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो प्रक्रिया के प्रमुख चरणों को रेखांकित करते हैं। इन संस्कृतियों को 15 दिनों तक विट्रो में बनाए रखा जा सकता है और इसके द्वारा हम सीजी संस्कृतियों के सामान्य विकास को दर्शाते हैं । परिणाम यह भी दर्शाते हैं कि ये न्यूरॉन्स न्यूरो-मस्कुलर कोलिनेर्जिक सिनेप्स के माध्यम से मांसपेशियों के तंतुओं के साथ बातचीत कर सकते हैं।
Introduction
सिलियरी गैंगलियन (सीजी) न्यूरॉन्स पैरासिम्पेथेटिक तंत्रिका तंत्र से संबंधित हैं। ये न्यूरॉन्स कोलिनेर्गिक होते हैं, जो मस्कैरिनिक या निकोटीनिक,सिनेप्स1,,2,3स्थापित करने में सक्षम होते हैं। शारीरिक रूप से, सीजी ऑप्टिक तंत्रिका (ओन) और कोरॉयड फिशर (सीएफ) के बीच आंख के पीछे के हिस्से में स्थित है और प्रारंभिक भ्रूण चरणों में लगभग 6000 न्यूरॉन्स होते हैं1,,4। संस्कृति में पहले सप्ताह के लिए, सिलियरी गैंगलियन न्यूरॉन्स एक बहुध्रुवीय आकृति विज्ञान प्रस्तुत करते हैं। एक सप्ताह के बाद, वे एक ध्रुवीय राज्य में संक्रमण शुरू करते हैं, जिसमें एक न्यूराइट विस्तार और अक्षत5का निर्माण होता है। इसके अलावा, सीजी न्यूरॉन्स के लगभग आधे लड़की भ्रूण विकास के8 वें और14 दिन के बीच मर जाते हैं, सेल मौत की एक प्रोग्राम प्रक्रिया के माध्यम से । न्यूरॉन्स की संख्या में इस कमी के परिणामस्वरूप लगभग 3000 न्यूरॉन्स6,7 , 8 की सिलियरी गैंगलियन की कुल,8आबादीहोती है । इन विट्रो में, मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ उगाए जाने पर सीजी न्यूरॉन्स की संख्या में कोई कमी नहीं है9 और सीजी न्यूरॉन्स को कई हफ्तों तक सुसंस्कृत किया जा सकता है1,,9।
सिलियरी गैंगलियन में सिलियरी न्यूरॉन्स और कोरॉयड न्यूरॉन्स की एक सजातीय आबादी होती है, प्रत्येक सीजी में न्यूरोनल आबादी के आधे का प्रतिनिधित्व करती है, जो आंख की मांसपेशियों को आंतरिक करती है। इन दो प्रकार के न्यूरॉन्स संरचनात्मक, शारीरिक और कार्यात्मक रूप से अलग होते हैं। सिलियरी न्यूरॉन्स इनरवेट आईरिस और लेंस पर स्ट्राइडेड मांसपेशी फाइबर, छात्र संकुचन के लिए जिम्मेदार होने के नाते। कोरॉइडल न्यूरॉन्स कोरॉइड 1 ,10 , 11,,,12की चिकनी मांसपेशी को आंतरिक रूप से अपने रूप में करते हैं ।1012
चिकन सिलियरी गैंगलियन न्यूरॉन्स की संस्कृतियों को न्यूरोमस्कुलर सिनेप्स और सिनैप्सगठन 1,5,9के अध्ययन के लिए उपयोगी उपकरण दिखाया गया है । यह देखते हुए कि न्यूरोमस्कुलर सिनेप्स कोलिनेर्गिक13हैं , एक न्यूरोनल आबादी का उपयोग करके जो कोलिनेर्जिक – सीजी न्यूरॉन्स है – पिछले सेल मॉडल14के संभावित विकल्प के रूप में उभरा । इन मॉडलों में एक विषम न्यूरोनल आबादी शामिल थी, जिसमें केवल एक छोटा सा हिस्सा कोलिनेर्गिक है। वैकल्पिक रूप से, सिलियरी गैंगलियन न्यूरॉन्स विट्रो में अपेक्षाकृत तेजी से विकसित होतेहैं, और लगभग 15 घंटे के बाद पहले से ही सिनैप्स1बनाते हैं। सीजी न्यूरॉन्स अलग अनुसंधान अध्ययन के लिए साल भर में एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया गया है, अलगाव और हेरफेर की अपेक्षाकृत आसानी के कारण । इन अनुप्रयोगों में ऑप्टोजेनेटिक अध्ययन, सिनेप्से विकास, एपोप्टोसिस और न्यूरोमस्कुलर इंटरैक्शन14,,15शामिल हैं।
हम भ्रूण दिवस 7 (E7) लड़की भ्रूण से सिलियरी गैंगलिया न्यूरॉन्स के विच्छेदन, वियोजन और इन विट्रो संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। हम कोलिनेर्गिक न्यूरॉन्स की अत्यधिक शुद्ध और स्थिर सेलुलर संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम प्रोटोकॉल के प्रमुख चरणों पर भी प्रकाश डालते हैं जिन पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है और इससे न्यूरोनल संस्कृतियों की गुणवत्ता में सुधार होगा। इन संस्कृतियों को कम से कम 15 दिनों तक विट्रो में बनाए रखा जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हमने सीजी न्यूरॉन्स को तैयार करने और संस्कृति का प्रदर्शन किया। सिलियरी गैंगलियन की पहचान और विच्छेदन अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के लिए मुश्किल हो सकता है। इसलिए, हम E7 चिक सिलियरी गैंगलि…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम का वित्तपोषण यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (ईआरडीएफ) द्वारा परियोजनाओं के तहत सेंट्रो 2020 क्षेत्रीय परिचालन कार्यक्रम के माध्यम से किया गया था- 01-0145-फेडरर-000008: ब्रेनहेल्थ 2020, सेंट्रो2020 सेंट्रो-01-0145-फेडर-00003:पीएज, सेंट्रो-01-0246-फेडरर-00018: मेडिसिस, और प्रतिस्पर्धा 2020 के माध्यम से – एफसीटी के माध्यम से प्रतिस्पर्धा और अंतर्राष्ट्रीयकरण और पुर्तगाली राष्ट्रीय निधियों के लिए परिचालन कार्यक्रम – Fundação पैरा एक Ciência e a Tecnologia, I.P., परियोजनाओं के तहत UIDB/04539/2020, यूआईडीबी/04501/2020, POCI-01-0145-FedER-022122: PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, और व्यक्तिगत अनुदान SFRH/BD/141092/2008 २०१८ (एमडी), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) और मैरी क्यूरी एक्शन द्वारा-IRG, 7 फ्रेमवर्क कार्यक्रम ।
Materials
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
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