Aislamiento y cultura de chick Ciliary Ganglion Neurons
Summary
Los ganglios ciliares son parte del sistema nervioso parasimpático. Cultivos neuronales de polluelos CG neuronas fueron demostrados para ser modelos celulares eficaces en el estudio de las interacciones musculares nerviosas. Describimos un protocolo detallado para la disección, disociación y cultivo in vitro de neuronas CG a partir de embriones de polluelos.
Abstract
Los polluelos ciliares (CG) son parte del sistema nervioso parasimpático y son responsables de la inervación de los tejidos musculares presentes en el ojo. Este ganglio está constituido por una población homogénea de neuronas ciliares y coroidales que inergen fibras musculares estriadas y lisas, respectivamente. Cada uno de estos tipos neuronales regulan las estructuras y funciones oculares específicas. Con los años, las culturas neuronales de los polluelos ganglios ciliares se demostraron para ser modelos celulares eficaces en el estudio de las interacciones del sistema músculo-nervioso, que se comunican a través de sinapsis colinérgicas. Las neuronas ganglionares ciliar son, en su mayoría, colinérgicas. Este modelo celular ha demostrado ser útil comparativamente a los modelos celulares heterogéneos utilizados anteriormente que comprenden varios tipos neuronales, además de colinérgicos. Anatómicamente, el ganglio ciliar se localiza entre el nervio óptico (ON) y la fisura coroides (CF). Aquí, describimos un procedimiento detallado para la disección, disociación y cultivo in vitro de neuronas ganglias ciliares de embriones de polluelos. Proporcionamos un protocolo paso a paso con el fin de obtener cultivos celulares altamente puros y estables de las neuronas CG, destacando los pasos clave del proceso. Estas culturas se pueden mantener in vitro durante 15 días y, por la presente, mostramos el normal desarrollo de las culturas CG. Los resultados también muestran que estas neuronas pueden interactuar con las fibras musculares a través de sinapsis colinérgicas neuromusculares.
Introduction
Las neuronas del ganglio ciliar (CG) pertenecen al sistema nervioso parasimpático. Estas neuronas son colinérgicas, pudiendo establecer sinapsis muscarnicas o nicotínicos1,2,3. Anatómicamente, el CG se encuentra en la parte posterior del ojo entre el nervio óptico (ON) y la fisura coroides (CF) y consiste en alrededor de 6000 neuronas en las primeras etapas embrionarias1,4. Durante la primera semana en el cultivo, las neuronas ganglionares ciliares presentan una morfología multipolar. Después de una semana, comienzan a pasar a un estado unipolar, con un neurito extendiendo y formando el axón5. Además, aproximadamente la mitad de las neuronas CG mueren entre eldía 8 y 14 del desarrollo del embrión del polluelo, a través de un proceso programado de muerte celular. Esta disminución en el número de neuronas resulta en una población total del ganglio ciliar de alrededor de 3000 neuronas6,7,8. In vitro, no hay reducción en el número de neuronas CG cuando se cultiva con células musculares9 y las neuronas CG se pueden cultivar durante varias semanas1,,9.
El ganglio ciliar consiste en una población homogénea de neuronas ciliares y neuronas coroideas, cada una representando la mitad de la población neuronal en el CG, inervando el músculo del ojo. Estos dos tipos de neuronas son estructural, anatómica y funcionalmente distintas. Las neuronas ciliares inerben las fibras musculares estriadas en el iris y la lente, siendo responsables de la contracción de la pupila. Las neuronas coroideas inerben el músculo liso de la coroides1,10,11,12.
Se ha demostrado que los cultivos de neuronas ganglionares ciliares de pollo son herramientas útiles para el estudio de las sinapsis neuromusculares y la formación de sinapsis1,5,9. Teniendo en cuenta que las sinapsis neuromusculares son colinérgicas13, utilizando una población neuronal que es colinérgico – CG neuronas – surgió como una alternativa potencial a los modelos celulares anteriores14. Estos modelos consistían en una población neuronal heterogénea, en la que sólo una pequeña parte es colinérgico. Alternativamente, las neuronas ganglionares ciliar se desarrollan relativamente rápido invitro, y después de aproximadamente 15 horas ya forman sinapsis1. Las neuronas CG se han utilizado como un sistema modelo a lo largo de los años para estudios de investigación distintos, debido a su relativa facilidad de aislamiento y manipulación. Estas aplicaciones incluyen estudios optogenéticos, desarrollo de sinapsis, apoptosis e interacciones neuromusculares14,15.
Describimos un procedimiento detallado para la disección, disociación y cultivo in vitro de neuronas gangliares ciliares de embriones de polluelos embrionarios día 7 (E7). Proporcionamos un protocolo paso a paso con el fin de obtener cultivos celulares altamente puros y estables de las neuronas colinérgicas. También destacamos los pasos clave del protocolo que requieren una atención especial y que mejorarán la calidad de las culturas neuronales. Estos cultivos se pueden mantener in vitro durante al menos 15 días.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, demostramos cómo preparar y cultivar las neuronas CG. La identificación y disección del ganglio ciliar puede ser difícil para los usuarios sin experiencia. Por lo tanto, presentamos un procedimiento detallado y paso a paso para diseccionar eficientemente los polluelos E7, disociar el tejido y preparar cultivos neuronales que se pueden mantener durante al menos 15 días. Las neuronas ganglionares ciliar obtenidas con este protocolo también son adecuadas para el cocultivo con células musculares.</p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), a través del Programa Operativo Regional Centro 2020 en el marco de los proyectos CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, y a través del PROGRAMA OPERACION 2020 – Programa Operativo para la Competitividad e Internacionalización y fondos nacionales portugueses a través de FCT – Fundación para una Ciudad Europea, I.P., en el marco de los proyectos UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, y las subvenciones individuales SFRH/BD/141092/12018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) y por Marie Curie Actions – IRG, 7th Framework Programme.
Materials
| 5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
| HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
| Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
| Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
| Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
| Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
| Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
| Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
| Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
| Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
| Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
| Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
| Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
| Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
| Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
| Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
| Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
| Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
| Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |
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