Chick ciliary ganglier (CG) är en del av det parasympatiska nervsystemet. Neuronala kulturer av chick CG nervceller visade sig vara effektiva cellmodeller i studien av nervmuskelinteraktioner. Vi beskriver ett detaljerat protokoll för dissekering, dissociation och in vitro kultur CG nervceller från chick embryon.
Chick ciliary ganglierna (CG) är en del av det parasympatiska nervsystemet och är ansvariga för innervation av muskelvävnader som finns i ögat. Denna ganglion består av en homogen population av ciliary och koroidala nervceller som innervate tvärstrimmiga och glatta muskelfibrer, respektive. Var och en av dessa neuronala typer reglerar specifika ögonstrukturer och funktioner. Under årens lopp, neuronala kulturer av chick ciliary ganglier visade sig vara effektiva cellmodeller i studien av muskel-nervsystemet interaktioner, som kommunicerar genom kolinerga synapser. Ciliary ganglion nervceller är, i sin majoritet, kolinerga. Denna cell modell har visat sig vara användbar jämförelsevis till tidigare använda heterogena cellmodeller som omfattar flera neuronala typer, förutom kolinerga. Anatomiskt är ciliary ganglion lokaliserad mellan synnerven (ON) och choroid spricka (CF). Här beskriver vi ett detaljerat förfarande för dissekering, dissociation och in vitro kultur ciliary ganglier nervceller från chick embryon. Vi erbjuder ett steg-för-steg-protokoll för att få mycket rena och stabila cellulära kulturer av CG nervceller, belysa viktiga steg i processen. Dessa kulturer kan upprätthållas in vitro i 15 dagar och härmed visar vi den normala utvecklingen av CG kulturer. Resultaten visar också att dessa nervceller kan interagera med muskelfibrer genom neuro-muskulös kolinerga synapser.
Ciliary ganglion (CG) nervceller tillhör det parasympatiska nervsystemet. Dessa nervceller är kolinerga, att kunna etablera muscarinic eller nikotin synapser1,2,3. Anatomiskt är CG ligger i den bakre delen av ögat mellan synnerven (ON) och choroid spricka (CF) och består av cirka 6000 nervceller i tidiga embryonala stadier1,4. För den första veckan i kultur, ciliary ganglion nervceller presentera en multipolär morfologi. Efter en vecka börjar de övergå till ett unipolärt tillstånd, med en neurit som sträcker sig och bildar axon5. Dessutom dör ungefär hälften av CG nervceller mellan den8: e och 14:e dagen av chick embryo utveckling, genom en programmerad process av celldöd. Denna minskning av antalet nervceller resulterar i en total population av ciliary ganglion av cirka 3000 nervceller6,7,8. In vitro, Det finns ingen minskning av antalet CG nervceller när odlas med muskelceller9 och CG nervceller kan odlas i flera veckor1,9.
Ciliary ganglion består av en homogen population av ciliary nervceller och koroidala nervceller, var och en representerar hälften av neuronala befolkningen i CG, innervating muskeln i ögat. Dessa två typer av nervceller är strukturellt, anatomiskt och funktionellt distinkta. Ciliary nervceller innervate tvärstrimmiga muskelfibrer på iris och lins, är ansvarig för elevkontraktion. Choroidal nervceller innervate glatt muskulatur choroid1,10,,11,12.
Kulturer av kyckling ciliary ganglion nervceller har visat sig vara användbara verktyg för studier av neuromuskulära synapser och synaps bildning1,5,9. Med tanke på att neuromuskulära synapser är kolinerga13, med hjälp av en neuronal population som är kolinerga – CG nervceller – framstod som ett potentiellt alternativ till tidigare cellmodeller14. Dessa modeller bestod i en heterogen neuronal population, där endast en liten del är kolinerga. Alternativt, ciliary ganglion nervceller utveckla relativt snabb in vitro, och efter cirka 15 timmar redan bilda synapser1. CG nervceller har använts som ett modellsystem genom åren för olika forskningsstudier, på grund av dess relativt enkel isolering och manipulation. Dessa tillämpningar inkluderar optogenetiska studier, synapsutveckling, apoptos och neuromuskulära interaktioner14,15.
Vi beskriver ett detaljerat förfarande för dissekering, dissociation och in vitro kultur ciliary gangli nervceller från embryonala dag 7 (E7) chick embryon. Vi erbjuder ett steg-för-steg-protokoll för att få mycket rena och stabila cellulära kulturer av kolinerga nervceller. Vi lyfter också fram viktiga steg i protokollet som kräver särskild uppmärksamhet och som kommer att förbättra kvaliteten på neuronala kulturer. Dessa kulturer kan upprätthållas in vitro i minst 15 dagar.
I detta protokoll visade vi hur man förbereder och kultur CG nervceller. Identifiering och dissekering av ciliary ganglion kan vara svårt för oerfarna användare. Därför presenterar vi en detaljerad och steg-för-steg förfarande för att effektivt dissekera E7 chick ciliary ganglier, separera vävnaden och förbereda neuronala kulturer som kan upprätthållas i minst 15 dagar. Ciliary ganglion nervceller som erhållits med detta protokoll är också lämpliga för samkultur med muskelceller.
<p class="jove_cont…The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av Europeiska regionala utvecklingsfonden (ERUF), genom det regionala operativa programmet Centro 2020 inom projekten CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, och genom COMPETE 2020 – Operativt program för konkurrenskraft och internationalisering och portugisiska nationella medel via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., under projekt UIDB/04539/2020. UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008 och de enskilda bidragen SFRH/BD/141092/2018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) och marie curie-åtgärder – IRG, sjunde ramprogrammet.
5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) | Merck (Sigma Aldrich) | F0503 | |
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody | Thermo Fisher Scientific | A11041 | |
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11031 | |
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
B27 supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
Chicken monoclonal neurofilament M | Merck (Sigma Aldrich) | AB5735 | |
D-(+)-Glucose monohydrate | VWR | 24371.297 | |
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil | Invitrogen (Gibco) | 10270-106 | |
HEPES, fine white crystals, for molecular biology | Fisher Scientific | 10397023 | |
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Invitrogen (Gibco) | 26050-070 | |
L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
Mouse laminin I | Cultrex (R&D systems) | 3400-010-02 | |
Mouse monoclonal b-III tubulin | Merck (Sigma Aldrich) | T8578 | |
Mouse monoclonal SV2 | DSHB | AB2315387 | |
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) | Thermo Fisher Scientific | 11874235 | |
Neurobasal medium without glutamine | Invitrogen (Gibco) | 21103-049 | |
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | |
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture | Merck (Sigma Aldrich) | P3532 | |
Poly-D-Lysine | Merck (Sigma Aldrich) | P7886 | |
Potassium chloride | Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) | 31248-1KG | |
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS | Panreac Applichem | 131509-1000 | |
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI | Invitrogen (Gibco) | P36935 | |
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk | Fisher Scientific | 10462200 | |
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | |
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Peprotech | 450-10 | |
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO | Panreac Applichem | 131659-1000 | |
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade | Panreac Applichem | 141677-1000 | |
Sodium Pyruvate 100 mM (100x) | Thermo Fisher | 11360039 | |
Syringe without needle, 10 mL | Thermo Fisher | 11587292 | |
Trypsin 1:250 powder | Invitrogen (Gibco) | 27250-018 |