Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons
Summary
Dit protocol laat zien hoe je microscopie met superresolutie gebruiken om eiwitcolokalisatie te bestuderen in primaire neuronale culturen.
Abstract
Synapsen zijn de functionele elementen van neuronen en hun gebreken of verliezen zijn aan de basis van verschillende neurodegeneratieve en neurologische aandoeningen. Beeldvormingsstudies worden veel gebruikt om hun functie en plasticiteit in fysiologische en pathologische omstandigheden te onderzoeken. Vanwege hun grootte en structuur vereisen lokalisatiestudies van eiwitten beeldvormingstechnieken met hoge resolutie. In dit protocol beschrijven we een procedure om in primaire neuronen de colokalisatie van doelproteïnen met synaptische markers op een superresolutieniveau te bestuderen met behulp van gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM). SIM is een patroon-licht verlichting techniek die de ruimtelijke resolutie van breed-veld microscopie verdubbelt, het bereiken van een detail van ongeveer 100 nm. Het protocol geeft de vereiste besturingselementen en instellingen aan voor robuuste colokalisatiestudies en een overzicht van de statistische methoden om de beeldgegevens goed te analyseren.
Introduction
Het begrip en de mening van de synaps is enorm veranderd sinds de eerste beschrijving door Foster en Sherrington in 18971. Sindsdien is onze kennis van neuronale communicatie en de moleculaire processen erachter exponentieel gegroeid2. Het is duidelijk geworden dat synapsen kunnen worden gezien als een systeem met twee compartimenten: een pre-synaptisch compartiment met vesikels voor het vrijkomen van neurotransmitters en een post-synaptisch compartiment met receptoren3. Deze simplistische visie, in de afgelopen twintig jaar, is uitgegroeid tot een complex netwerk van de eiwitten die nodig zijn om zenderbinding om te zetten in signalering4.
De winst in het begrip zijn deels te wijten aan super-resolutie technieken die de diffractie limiet van conventionele licht microscopie om de dimensie van synapsen beter aan te passen5,6,7,8,9,10. Vanwege de diffractielimiet kan een optische microscoop geen resolutie bereiken van meer dan 200 nm lateraal11,12. Om deze limiet te omzeilen, werden superresolutietechnieken gemaakt, met behulp van verschillende benaderingen en het bereiken van verschillende subdiffractielimietresoluties: SIM, STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) en STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM verdubbelt de ruimtelijke resolutie van lasergebaseerde microscopiesystemen op basis van laservelden door een diffractierooster in het excitatiestraalpad15in te voegen. De beweegbare rooster diffracts de laserstralen om een bekende verlichting patroon, meestal strepen te creëren. Dit doelbewust gestructureerde lichtpatroon wordt bovenop de onbekende ruimtelijke verdeling van de fluorescerende kleurstof (van het monster) geplaatst. De interferentie franjes gevormd door de twee patronen coderen voor anders niet te onderscheiden fijne details met normale breedveld microscopie. De uiteindelijke super-resolved beeld wordt verkregen door het combineren en decoderen met wiskundige methoden verschillende ruwe beelden van hetzelfde monster verkregen door de vertalingen en rotaties van de diffractie rooster. De resolutie van de super-opgeloste beelden bereikt 100 nm in de laterale en 500 nm in de axiale richtingen voor 2D-SIM15 of 100 nm in de laterale en 250 nm in de axiale richtingen voor 3D-SIM16.
Het nieuwe begrip van de synaps is nog belangrijker in het licht van de vele neurologische aandoeningen waarbij synaptische disfunctie een belangrijke rol speelt bij het begin en progressie17,18. De ziekte van Alzheimer, Het syndroom van Down, de ziekte van Parkinson, prionziekten, epilepsie, autismespectrumstoornissen en fragiel x-syndroom zijn onder andere gekoppeld aan afwijkingen in synaptische samenstelling, morfologie en functie19,20,21,22.
Onlangs, met behulp van een set van SUMO-specifieke antilichamen, gebruikten we SIM om co-lokalisatie te tonen in primaire hippocampal neuronen van de SUMO eiwitten met de pre- en post-synaptische markers synaptophysine en PSD95 op super-resolutie niveau23. Dit stelde ons in staat om biochemische en confocale microscopie bewijs van SUMO lokalisatie in neuronen te bevestigen.
Hier beschrijven we een protocol om de lokalisatie van eiwitten in muis hippocampal primaire neuronen te bestuderen. Tegelijkertijd kan dit protocol worden aangepast aan verschillende soorten primaire neuronale culturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het ophelderen van de structuur en samenstelling van de synaps is cruciaal voor het begrijpen van de fysiologische en pathologische processen die geheugen en cognitie reguleren. Terwijl in de normale staat, synapsen zijn de bouwstenen van het geheugen, ze ook ten grondslag liggen aan complexe neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer32. Het hier beschreven protocol dient om de colokalisatie van neuronale eiwitten te bestuderen met een microscopietechniek met superresolutie genaamd S…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Edoardo Micotti bedanken voor de opbouwende kritiek op het manuscript. Deze studie werd ondersteund door BrightFocus A2019296F, door Fondo di Beneficenza – Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), door Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) en door het Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (JK).
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | – | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
| Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
| Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
| Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |
References
- Foster, M., Sherrington, C. S. . A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).
- Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- McAllister, A. K. Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).
- Yuzaki, M. Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System. Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
- Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
- Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy. Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).
- Yang, X., Specht, C. G. Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).
- Monro, T. Beyond the diffraction limit. Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).
- Won, R. Eyes on super-resolution. Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Brose, N., O’Connor, V., Skehel, P. Synaptopathy: dysfunction of synaptic function. Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).
- Tyebji, S., Hannan, A. J. Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington’s disease. Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).
- Won, H., Mah, W., Kim, E. Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. The State of Synapses in Fragile X Syndrome. The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).
- Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability. Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).
- Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem. International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).
- Colnaghi, L., et al. Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach. Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).
- Culley, S., et al. NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts. Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
- Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).
- Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Karras, C., et al. Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy – A practical guide. Optics Communications. 436, 69-75 (2019).
- Bereczki, E., et al. Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach. Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).
- Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila. Science. 324 (5923), 109-112 (2009).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
