Summary

Получение человеческой микроглии от взрослых тканей мозга человека

Published: August 30, 2020
doi:

Summary

Этот протокол является эффективным, экономически эффективным и надежным методом изоляции первичной микроглии от живой, взрослой, человеческой ткани мозга. Изолированная первичная микроглия человека может служить инструментом для изучения клеточных процессов при гомеостазе и болезнях.

Abstract

Микроглии являются резидентами врожденных иммунных клеток центральной нервной системы (ЦНС). Микроглии играют важную роль во время развития, в поддержании гомеостаза, а также во время инфекции или травмы. Несколько независимых исследовательских групп подчеркнули центральную роль, которую микроглии играют в аутоиммунных заболеваниях, аутовоспалительных синдромах и раковых заболеваниях. Активация микроглии при некоторых неврологических заболеваниях может непосредственно участвовать в патогенных процессах. Первичная микроглия является мощным инструментом для понимания иммунных реакций в головном мозге, клеточных клеточных взаимодействий и дисрегулируемых фенотипов микроглии при болезни. Первичная микроглия имитирует микроглиальные свойства vivo лучше, чем увековеченные линии микроглиальных клеток. Человеческая взрослая микроглия обладают различными свойствами по сравнению с человеческими микроглией плода и грызунов. Этот протокол обеспечивает эффективный метод изоляции первичной микроглии от взрослого человеческого мозга. Изучение этих микроглии может обеспечить критическое понимание клеточного взаимодействия между микроглией и другими резидентами клеток в ЦНС, включая олигодендроциты, нейроны и астроциты. Кроме того, микроглии из разных человеческих мозгов могут быть культуры для характеристики уникальных иммунных реакций для персонализированной медицины и множество терапевтических приложений.

Introduction

Центральная нервная система (ЦНС) построена из сложной сети нейронов и глиальных клеток1. Среди глиальных клеток, микроглии функции врожденных иммунных клеток ЦНС2,3. Microglia отвечают за поддержание гомеостаза в здоровом ЦНС4. Microglia также играют важную роль в нейроразвитии, путем обрезки синапсов2. Микроглии занимают центральное место в патофизиологии нескольких неврологических заболеваний, включая, но не ограничиваясь; Болезнь Альцгеймера5, болезнь Паркинсона6, инсульт7, рассеянный склероз8, черепно-мозговая травма9, невропатические боли10, повреждение спинного мозга11 и опухоли головного мозга, такие как глиомы12.

Исследования, связанные с ГОМеостазом ЦНС и заболеваний использовать грызунов микроглии из-за нехватки экономически эффективным и время эффективного человека первичной микроглии изоляции протоколов13. Грызун микроглии напоминают первичной микроглии человека в экспрессии генов, таких как Iba-1, PU.1, DAP12 и M-CSF рецепторов и были эффективными в понимании нормального, а также больной мозг13. Интересно, что экспрессия нескольких ген, связанных с иммунитетом, таких как TLR4, MHC II, Siglec-11 и Siglec-3 варьируется между человеком и грызунами микроглии13. Выражение нескольких генов также варьируется в височной экспрессии и в нейродегенеративных заболеваний у обоих видов14,15. Эти значительные различия делают микроглию человека важной моделью для изучения функции микроглии при гомеостазе и болезни. Первичная человеческая микроглия также может быть эффективным инструментом для доклинического скрининга потенциальных кандидатов наркотиков16. Вышеупомянутые причины подчеркивают растущую потребность в экономически эффективных протоколах для изоляции первичной микроглии человека.

Мы разработали протокол изоляции первичной микроглии человека от тканей мозга взрослого человека, собранного в результате хирургического окна, созданного для резекции опухоли или других хирургических резекций. Метод здесь значительно отличается от существующих методов. Мы смогли изолировать и культуры микроглии после транзита время около 75 минут от места сбора тканей, чтобы начать изоляционный протокол в лаборатории. Мы использовали супернатант клеток фибробластов L929 для содействия росту изолированной микроглии. Этот метод конкретно фокусируется на культуре и развитии только первичной микроглии. Подготовленная в результате культура составляет около 80% микроглии. В то время как другие протоколы обеспечивают обогащенную культуру микроглии по плотности градиента центрифугации, потока цитометрии и магнитных бусин, протокол является быстрым, простым, надежным и экономически эффективным способом культуры первичной человеческой микроглии17,18,19,20. Способность использовать хирургически удалены живой ткани мозга взрослого вместо фиксированных тканей мозга из трупов доказывает дополнительное преимущество этого метода в отличие от существующих процедур18,21.

Protocol

Все ткани были приобретены после этического разрешения от комитетов по этике института Индийского технологического института Джодхпура и Всеиндийского института медицинских наук (AIIMS) Джодхпура. 1.Tissue приобретения и обработки (День 0) Соберите ткань в трубке 50 мл, с?…

Representative Results

Используя вышеупомянутый протокол(Рисунок 1),мы смогли изолировать первичную микроглию человека от живых хирургически резекированных тканей мозга. Культурные клетки были окрашены Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) лектин для микроглии (зеленый) и с Глиальным ?…

Discussion

Микроглии обеспечивают гомеостаз в нормальном мозге и играют центральную роль в патофизиологии различных неврологических заболеваний4. Микроглии имеют центральное значение для нейроразвития и формирования синапсов2. Микроглиальные исследования оказались ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Лаборатория SJ была создана на институциональных грантах от IITJ и финансируется за счет грантов Департамента биотехнологии (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) и Министерства электроники и информационных технологий Правительства Индии (No 4 (16)/2019-ITEA). Участки ткани мозга человека были получены из Всеиндийского института медицинских наук (AIIMS) Jodhpur после институционального разрешения комитета по этике. Мы благодарим Майанк Ратор, B.Tech Студент член дизайна и искусства общества IIT Jodhpur, за поддержку видеосъемки.

Materials

Antibiotic-Antimycotic solution Himedia A002
Calcium chloride Sigma 223506
Centrifuge (4 °C) Sigma 146532
Centrifuge tubes Abdos P10203
CO2 incubator New Brunswik Galaxy 170 S
D-Glucose Himedia GRM077
DMEM medium with glutamine Himedia AL007S
Fetal bovine serum Himedia RM9955
Flacon tube (50 ml) Thermo Fsiher Scientific  50CD1058
Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 Vector FL-1081
Fluorescent microscope Leica DM2000LED
Fluoroshield with DAPI Sigma F6057
GFAP antibody GA5 3670S
Incubator shaker New Brunswik Scientific Innova 42
L929 cell line ATCC NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1)
Laminar air flow Thermo Fsiher Scientific  1386
Magnesium chloride Himedia MB040
Monosodium phosphate Merck 567545
Nutrient Mixture F-12 Ham Medium Himedia Al106S
Petri dish Duran Group 237554805
Phosphate buffered saline Himedia ML023
Potassium chloride Himedia MB043
Serological pipette Labware LW-SP1010
Sodium bicarbonate Himedia MB045
Sucrose Himedia MB025
Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) Axiva SFPV25R
T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. Himedia TCG4-20X10NO
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco  25200-056

References

  1. Allen, N. J., Barres, B. A. Glia – more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
  2. Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
  3. Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
  4. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  5. Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer’s disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
  6. Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).
  7. Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
  8. Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
  9. Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).
  10. Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
  11. Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).
  12. Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
  13. Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
  14. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  15. Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer’s Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
  16. Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer’s disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).
  17. Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
  18. Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).
  19. Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).
  20. Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
  21. Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
  22. Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).
  23. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
  24. Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
  25. Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).
  26. Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
  27. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).
  28. Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
  29. Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).

Play Video

Cite This Article
Agrawal, I., Saxena, S., Nair, P., Jha, D., Jha, S. Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (162), e61438, doi:10.3791/61438 (2020).

View Video