माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं से तंत्रिका जनक और न्यूरॉन्स का भेदभाव और लक्षण वर्णन
Summary
हम हैंगिंग ड्रॉप विधि का उपयोग करके न्यूरोनल कोशिकाओं में माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं के इन विट्रो भेदभाव के लिए प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम आरटी-क्यूपीसीआर, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, आरएनए-सेक्यू और फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से एक व्यापक फेनोटाइपिक विश्लेषण करते हैं।
Abstract
हम न्यूरॉनल वंश में माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं को बनाने और अलग करने के लिए कदम-दर-कदम प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, जिसके बाद विभेदित कोशिकाओं की विशेषता के लिए परख की एक श्रृंखला होती है। E14 माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं को फांसी ड्रॉप विधि के माध्यम से भ्रूण निकायों के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और फिर रेटिनोइक एसिड द्वारा तंत्रिका जनक कोशिकाओं में अंतर करने के लिए प्रेरित किया, और अंत में न्यूरॉन्स में विभेदित । मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों से पता चला है कि तंत्रिका जनक और न्यूरॉन्स क्रमशः 8 और 12 के बाद भेदभाव के दिन में इसी मार्कर (तंत्रिका जनकों के लिए नेस्टिन और न्यूरॉन्स के लिए न्यूरोफिलामेंट) प्रदर्शित करते हैं। एक Sox1 प्रमोटर संचालित GFP रिपोर्टर व्यक्त एक E14 लाइन पर प्रवाह साइटोमेट्री प्रयोगों से पता चला है कि 8 दिन में कोशिकाओं के बारे में ६०% GFP सकारात्मक हैं, इस स्तर पर तंत्रिका जनक कोशिकाओं के सफल भेदभाव का संकेत है । अंत में, आरएनए-एसईक्यू विश्लेषण का उपयोग वैश्विक ट्रांसक्रिप्टोस्मिक परिवर्तनों को प्रोफाइल करने के लिए किया गया था। ये विधियां न्यूरोनल भेदभाव के दौरान कोशिका पहचान संक्रमण को विनियमित करने में विशिष्ट जीन और रास्तों की भागीदारी का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी हैं।
Introduction
चूंकि विकासशील माउस ब्लास्टोसिस्ट1,2,माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं (एमईएससी) के आंतरिक कोशिका द्रव्यमान से उनके पहले व्युत्पन्न को स्टेम सेल आत्म-नवीकरण और भेदभाव3का अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, एमईएससी भेदभाव का अध्ययन करने से आणविक तंत्रों की जबरदस्त समझ होती है जो न्यूरोडीजेनेरेटिवविकारों जैसेरोगों के इलाज में स्टेम सेल आधारित चिकित्सा में दक्षता और सुरक्षा में सुधार कर सकती है 4 । पशु मॉडल की तुलना में, यह इन विट्रो सिस्टम अभ्यास और मूल्यांकन में सादगी, जानवरों के विपरीत सेल लाइनों को बनाए रखने में कम लागत, और आनुवंशिक जोड़तोड़ में सापेक्ष आसानी सहित कई फायदे प्रदान करता है। हालांकि, विभेदित कोशिका प्रकारों की दक्षता और गुणवत्ता अक्सर एमएससी की विभिन्न रेखाओं के साथ – साथ भेदभाव विधियों5,6से प्रभावित होती है। इसके अलावा, अंतर दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए पारंपरिक परख चयनित मार्कर जीन की गुणात्मक परीक्षा पर भरोसा करते हैं जिसमें मजबूती की कमी है और वे इसलिए जीन अभिव्यक्ति में वैश्विक परिवर्तनों को समझने में विफल रहते हैं ।
यहां हम न्यूरोनल भेदभाव के व्यवस्थित मूल्यांकन के लिए परख की एक बैटरी का उपयोग करने का लक्ष्य है। चयनित मार्कर और आरएनए-सेक्यू पर पारंपरिक इन विट्रो विश्लेषणों का उपयोग करके, हम इस प्रक्रिया के दौरान भेदभाव दक्षता के साथ-साथ ट्रांसक्रिप्टोमिक परिवर्तनों के मापन के लिए एक मंच स्थापित करते हैं। पहले से स्थापित प्रोटोकॉल7के आधार पर, हमने हैंगिंग ड्रॉप तकनीक के माध्यम से भ्रूण निकायों (ईबी) उत्पन्न किए, जिसके बाद तंत्रिका जनक कोशिकाओं (एनपीसी) उत्पन्न करने के लिए रेटिनोइक एसिड (आरए) की सुपरफिजियोलॉजिक मात्रा का उपयोग करके प्रेरण किया गया, जिसे बाद में तंत्रिका प्रेरण माध्यम के साथ न्यूरॉन्स में अंतर किया गया। भेदभाव की दक्षता की जांच करने के लिए, पारंपरिक आरटी-क्यूपीसीआर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) परख के अलावा, हमने आरएनए-सेक्यू और प्रवाह साइटोमेट्री का प्रदर्शन किया। ये विश्लेषण चरण-विशिष्ट भेदभाव की प्रगति का व्यापक मापन प्रदान करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं के तंत्रिका भेदभाव के लिए विधि दशकों से स्थापित की गई है और शोधकर्ताओं ने पिछले प्रोटोकॉल को संशोधित करना जारी रखा है या विभिन्न प्रयोजनों के लिए नए बनाने के लिए7<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच (1R35GM1333496-01) से जेड गाओ तक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम सेक्शनिंग में सहायता के लिए डॉ रयान हाब्स को धन्यवाद देना चाहते हैं । हम पेन स्टेट कॉलेज ऑफ मेडिसिन की मुख्य सुविधाओं का शुक्रिया अदा करते हैं, जिनमें जीनोम साइंसेज एंड बायोइन्फॉर्मेटिक्स, एडवांस्ड लाइट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और फ्लो साइटोमेट्री शामिल हैं । हम आरएनए-सेक्यू विश्लेषण में सहायता के लिए डॉ युका इमामुरा को भी धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| – Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| – Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| – Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| – Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
References
- Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
- Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
- Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
- Park, Y. -. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
- Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
- Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
- Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
- Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
- Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
- Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
- Antill-O’Brien, N., Bourke, J., O’Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).
