Summary
Describimos el procedimiento para la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en células neuronales utilizando el método de la gota colgante. Además, realizamos un análisis fenotípico exhaustivo a través de RT-qPCR, inmunofluorescencia, ARN-seq y citometría de flujo.
Abstract
Describimos el procedimiento paso a paso para cultivar y diferenciar las células madre embrionarias de ratón en linajes neuronales, seguido de una serie de ensayos para caracterizar las células diferenciadas. Las células madre embrionarias de ratón E14 se utilizaron para formar cuerpos embrionarios a través del método de la gota colgante, y luego se indujeron a diferenciarse en células progenitoras neurales por ácido retinoico, y finalmente se diferenciaron en neuronas. Los experimentos cuantitativos de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-qPCR) e inmunofluorescencia revelaron que los progenitores neurales y las neuronas exhiben marcadores correspondientes (nestina para los progenitores neurales y neurofilamento para las neuronas) en los días 8 y 12 después de la diferenciación, respectivamente. Los experimentos de citometría de flujo en una línea E14 que expresan un informador de GFP impulsado por el promotor Sox1 mostraron que aproximadamente el 60% de las células en el día 8 son GFP positivas, lo que indica la diferenciación exitosa de las células progenitoras neurales en esta etapa. Finalmente, se utilizó el análisis RNA-seq para perfilar los cambios transcriptómicos globales. Estos métodos son útiles para analizar la participación de genes y vías específicas en la regulación de la transición de la identidad celular durante la diferenciación neuronal.
Introduction
Desde su primera derivación de la masa celular interna de los blastocistos de ratón en desarrollo1,2,las células madre embrionarias de ratón (mESC) se han utilizado como herramientas poderosas para estudiar la autorrenovación y diferenciación de las células madre3. Además, el estudio de la diferenciación mESC conduce a una tremenda comprensión de los mecanismos moleculares que pueden mejorar la eficiencia y la seguridad en la terapia basada en células madre en el tratamiento de enfermedades como los trastornos neurodegenerativos4. En comparación con los modelos animales, este sistema in vitro proporciona muchas ventajas, incluida la simplicidad en la práctica y la evaluación, el bajo costo en el mantenimiento de las líneas celulares en contraste con los animales y la relativa facilidad en las manipulaciones genéticas. Sin embargo, la eficiencia y la calidad de los tipos de células diferenciadas a menudo se ven afectadas por diferentes líneas de mESCs, así como por los métodos de diferenciación5,6. Además, los ensayos tradicionales para evaluar la eficiencia de la diferenciación se basan en el examen cualitativo de genes marcadores seleccionados que carecen de robustez y, por lo tanto, no logran comprender los cambios globales en la expresión génica.
Aquí pretendemos utilizar una batería de ensayos para la evaluación sistemática de la diferenciación neuronal. Utilizando tanto análisis tradicionales in vitro en marcadores seleccionados como ARN-seq, establecemos una plataforma para medir la eficiencia de diferenciación, así como los cambios transcriptómicos durante este proceso. Basándonos en un protocolo previamente establecido7,generamos cuerpos embrioides (EB) a través de la técnica de gota colgante, seguida de la inducción utilizando cantidad suprafisiológica de ácido retinoico (AR) para generar células progenitoras neurales (NPC), que posteriormente se diferenciaron a neuronas con medio de inducción neural. Para examinar la eficiencia de la diferenciación, además de los ensayos tradicionales de RT-qPCR e inmunofluorescencia (IF), se realizó citometría de flujo y ARN-seq. Estos análisis proporcionan una medición exhaustiva de la progresión de la diferenciación específica de la etapa.
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Protocol
1. Cultura mESC
- Cubra una placa tratada con cultivo de tejidos de 10 cm con gelatina al 0,1% y deje que la gelatina se fije durante al menos 15-30 minutos antes de aspirarla.
- Semilla γ fibroblastos embrionarios de ratón irradiados (MEF) un día antes de cultivar las mESC en el medio mESC precalentado (medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco con suero fetal bovino (FBS) al 15%), aminoácidos no esenciales, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina/estreptomicina, piruvato de sodio, LIF, PD0325901 (PD) y Chir99021 (CH)).
- Permita que los MEFs irradiados por γ se asienten y se adhieran a la superficie de la placa antes de cultivar las células E14.
- Descongele las ESC E14 en un baño de agua a 37 °C y transfiera rápidamente las células en un tubo cónico de 15 cm con medio mESC caliente. Peletizar las células a 200 x g durante 3 min y retirar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 10 ml de medio mESC y colocar las células en la placa de cultivo que contiene los MEFs γ irradiados sembrados anteriormente. Incubar el cultivo celular en una incubadora de 37 °C bajo 5% de CO2.
- Para el pasaje de cultivo, aspire e el medio y lave la placa con 1x PBS estéril. Agregue suficiente tripsina al 0.05% para cubrir la superficie de la placa e incube a 37 ° C durante 3 min.
- Neutralizar la tripsina con medio mESC y pipeta para generar suspensión unicelular. Centrifugar las células a 200 x g durante 3 min y retirar el sobrenadante.
- Cuente las células con un hemocitómetro o contador celular y siembre aproximadamente 5.0 x 105 células en una placa de cultivo de 10 cm.
- Resuspend las células en 10 ml de medio mESC, placa las células en la placa de cultivo de tejido recubierta de gelatina e incuba cultivos como se describió anteriormente.
NOTA: Se recomienda que las mESCs se pasen cada 2 días para evitar que las células se diferencien en sus colonias. El rojo fenol en el medio funciona únicamente como un indicador de pH y dependiendo de la densidad celular, puede volverse amarillento (más ácido), antes de 2 días. Por lo tanto, puede ser necesario cambiar el medio todos los días. Los MEF irradiados por γ eventualmente morirán después de un par de pasajes.
2. EB, NPC y diferenciación neuronal
- Realice el protocolo de paso de cultivo mencionado anteriormente y cuente las células (pasos 1.7-1.10).
- Método de caída colgante (día 0)
- Para una placa de cultivo celular de 10 cm, cuente aproximadamente 2.5 x 104 células donde 5.0 x 102 células se suspenderán en un medio de diferenciación de 20 μL (DMEM con 15% de FBS, aminoácidos no esenciales, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina / estreptomicina y piruvato de sodio). Aproximadamente cincuenta gotas de 20 μL que contienen las células se pueden enchapar en una placa de 10 cm.
- Alícuota el número apropiado de células, y luego centrifuga las células a 200 x g durante 3 min y retire el sobrenadante.
- Resuspender las células en el volumen apropiado del medio de diferenciación para una densidad celular de 5,0 x 102 células por 20 μL (por ejemplo, 2,5 x 104 células en 1 mL de medio de diferenciación).
- Usando una micropipeta o una pipeta repetidora, coloque gotas de 20 μL de la suspensión celular en la tapa de la placa de cultivo de tejidos. Asegúrese de que las gotas no estén demasiado cerca unas de otras para evitar que se fusionen.
NOTA: Las gotas se pueden enchapar en una placa de fijación tratada con cultivo de tejidos o en una placa de suspensión, ya que se colocarán en la tapa y no en la placa en sí. Para un enfoque más factible y estéril, coloque las gotas en una placa de cultivo de tejido de fijación y transfiéralas a una placa de suspensión como se describe a continuación. - Llene el plato con 5-10 ml de 1x PBS y vuelva a colocar cuidadosamente la tapa en el plato. Incubar el cultivo en la incubadora de 37 °C.
NOTA: PbS se agrega a la placa de cultivo para evitar que las gotas se sequen.
- El día 2,use una micropipeta para recoger las gotas de la tapa y colóquelas en una placa de suspensión de cultivo celular de 10 cm llena de 10 ml de medio de diferenciación. Incubar el cultivo en un agitador orbital que tiembla a baja velocidad en la incubadora.
- El día 4,para cosechar los EB, recolectar las células, centrifugar a 200 x g durante 3 min y retirar el sobrenadante.
NOTA: Los EB también se pueden lavar con 1x PBS según los requisitos de los experimentos posteriores. - Para continuar el procedimiento e inducir la diferenciación EB en células progenitoras neurales (NPC), prepare el medio de diferenciación con ácido retinoico (AR) de 5 μM.
- Retire el medio viejo peletizando los EB a 100 x g durante 3 minutos o permita que los EB se asienten antes de aspirar el medio viejo. Añadir 10 ml del medio de diferenciación que contiene 5 μM de AR a la placa de cultivo.
- El día 6, reemplace al menos la mitad del medio con un medio fresco que contenga 5 μM ra inclinando la placa y canalizando el medio como se describió anteriormente.
NOTA: Se recomienda que al menos la mitad del medio se reemplace con un medio fresco que contenga AR los días 5 y 7. Tome nota del indicador rojo fenol; si se vuelve amarillento, es mejor reemplazar todo el medio. - El día 8,cosecha los NPC recolectando las células, centrifugando a 200 x g durante 3 min, y retirando el sobrenadante.
NOTA: Los NPC también se pueden lavar con 1x PBS de acuerdo con las necesidades de los experimentos posteriores. Si es necesario, los NPC pueden congelarse y descongelarse nuevamente para su posterior cultivo y análisis. Si los NPC van a ser cultivados, la accutasa también se puede utilizar como una alternativa a la tripsina. - Para continuar el procedimiento y diferenciar los NPC en neuronas, recoja los NPC en un tubo cónico de 15 ml por centrifugación, disocie con tripsina e incube a 37 °C durante 3 min. Pipetear los NPC para asegurarse de que todos los agregados de NPC estén disociados y neutralizar la tripsina con el medio.
- Filtrar las células con un colador de células de nylon de 40 μm y contar las células antes de enchaparlas a una densidad de 1,5 x10 5/cm2 en medio N2 (medio DMEM/F12 + 3 mg/ml de glucosa + 3 mg/ml de albúmina bovina rica en lípidos (LBSA) + suplemento de 1:100 N2 + 10 ng/mL de bFGF + 50 U/mL de pluma/estreptococo + 1 mM de L-glutamina) en una placa tratada con cultivo de tejidos para experimentos posteriores de PCR y western blot; o en una cámara de cultivo de tejidos para experimentos de inmunofluorescencia.
- El día 9,reemplace el medio antiguo por un medio N2 fresco.
- El día 10,cambie el medio N2 con medio N2 / B27 (50% DMEM / F12 y 50% basal neural, 3 mg / ml LBA, suplemento 1: 200 N2, suplemento 1: 100 B27, 50 U / ml pluma / estreptococo y 1 mM L-glutamina).
- En los días 11-12,cosecha las neuronas de la siguiente manera. Lave las células con 1x PBS, agregue tripsina e incube el cultivo en la incubadora de 37 °C durante 3 min antes de neutralizar la tripsina con medio y centrífuga a 200 x g durante 3 min.
3. Caracterización de mESCs y células diferenciadas
- Ensayo de fosfatasa alcalina (AP)
- Use un kit para evaluar la actividad de la fosfatasa alcalina (consulte la Tabla de materiales).
- Retire el medio de la placa de cultivo y lave los ESC con 1x PBS.
- Agregue 1 ml de la solución fija (consiste en formaldehído y metanol) provisto con el kit a la placa e incube a temperatura ambiente durante 2-5 min.
NOTA: La sobreincubación en la solución fix puede comprometer la actividad de AP. - Retire la solución fija, lave los ESC con 1x PBS y deje cierta cantidad de PBS en la placa.
NOTA: Mantenga los ESC húmedos en PBS para no comprometer la actividad de AP. - Prepare la solución AP mezclando las soluciones de sustrato A, B y C en una proporción de 1:1:1. Mezcle primero las soluciones A y B e incube la mezcla a temperatura ambiente durante 2 minutos antes de agregar la solución C.
- Retire el PBS 1x y agregue la solución AP preparada anteriormente.
- Incubar los ESC durante unos 15 minutos en la oscuridad envolviendo la placa de cultivo con papel de aluminio o realizando el paso 3.5 en una habitación oscura.
- Controle la reacción y retire la solución de reacción cuando la solución se vuelva brillante para evitar manchas no específicas.
- Lave los ESC dos veces con 1x PBS.
- Evite que la muestra se seque cubriendo los ESC con 1x PBS o medio de montaje.
NOTA: Aparecerá una mancha roja o púrpura para la expresión AP. La placa se puede almacenar en un refrigerador de 4 °C.
- RT-qPCR
- Recolecte células en varias etapas siguiendo los pasos 1.6–1.7 y 2.4 para ESC y EB y NPC, respectivamente.
- Aislar el ARN utilizando ARN, ADN y solución de extracción de proteínas (ver Tabla de Materiales).
- Genere ADNc con un kit de transcriptasa inversa (consulte la Tabla de materiales)y siga el manual del fabricante.
- Fijación e incrustación
- Coseche los EB y los NPC como se describió anteriormente (paso 2.6) y corríjalos con una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% en 1x PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
- Retire el PFA y lave la muestra con 1x PBS durante 5 min.
- Coloque la muestra en una dilución en serie de 1x soluciones de PBS, 10%-, 20%-, y 30%-sacarosa a 25\u201228 °C donde la muestra se transfiere a la siguiente solución después de 30 min de incubación.
NOTA: La muestra se puede almacenar en la solución de sacarosa al 30% a 4 °C antes de continuar con el paso de incrustación. - Humedezca la punta de la pipeta con solución de sacarosa antes de colocar la muestra (sin apilarla) en el centro del criomolde y pipetee el exceso de líquido.
NOTA: El papel de filtro también se puede utilizar para eliminar el exceso de solución. Mojar la punta de la pipeta con solución de sacarosa es importante para evitar que los EB y los NPC se peguen a las paredes de la punta. - Agregue cuidadosamente la solución de temperatura de corte óptima (OCT) al molde sin volver a suspender las muestras y elimine el exceso de burbujas con una pipeta.
- Coloque el molde con la muestra en un mezclador de laboratorio a baja velocidad para agitar ligeramente la muestra durante 15 minutos. Esto ayuda a asentar los EB y NPC al fondo si se vuelven a suspender en la solución oct.
- Congele rápidamente la muestra colocando el molde en nitrógeno líquido o sobre hielo seco.
NOTA: Las muestras se pueden almacenar en un congelador de -70 °C antes de continuar con el siguiente paso.
- Crioseccionado
- Ajuste el criostato para que se enfríe a -20 a -18 °C antes de transferir la muestra al instrumento.
- Separe el bloque de OCT congelado del molde y asegúrelo en el soporte con una pequeña solución de OCT colocada en la superficie del soporte.
- Alinee el bloque oct para que los EB y los NPC estén más cerca de la hoja para asegurarse de que la muestra no se pierda durante la sección.
- Separe cuidadosamente 10 μm del bloque y preste mucha atención a las rodajas que contienen la muestra.
- Coloque rápidamente la rebanada de OCT que contiene la muestra en el portaobjetos de vidrio que incrusta tejido y permita que las rebanadas de OCT se sequen al aire durante 1 h a temperatura ambiente.
NOTA: Las muestras se pueden almacenar a -70 °C para su uso posterior.
- Inmunofluorescencia (IF)
- Bloquee las secciones de OCT o las cámaras de cultivo que contienen neuronas en un 10% de suero de burro normal / 0.1% Triton X-100 en 1x PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
- Incubar las muestras en anticuerpo primario diluido en suero de burro normal al 5%/Tritón X-100 al 0,05% en 1x PBS durante la noche a 4 °C.
- Lave las muestras en 1x PBS/0.1% Triton X-100 tres veces durante 5 min cada lavado.
- Incubar las muestras con anticuerpos secundarios diluidos en suero de burro normal al 5%/Tritón X-100 al 0,05% en 1x PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lave las muestras en 1x PBS/0.1% Triton X-100 tres veces durante 5 min cada lavado y luego incube las muestras en 1 μg/mL DAPI.
- Monte las muestras con una funda y algún medio de montaje y deje que se seque.
- Observe las muestras bajo un microscopio de fluorescencia.
- Análisis de ARN-seq
- Recolecte las células en varias etapas y realice la extracción de ARN (ver paso 3.2).
- Preparar las bibliotecas de ADNc, realizar secuenciación profunda y análisis de datos según el protocolo descrito en Wang et al.8.
- Realice el análisis de Ontología Génica (GO) utilizando el paquete R, clusterProfiler.
- Citometría de flujo
- Recolecte escasiadas siguiendo los pasos 1.6–1.7 y vuelva a suspender las células en medio. Recoge los EB y NPC siguiendo el paso 2.4 y vuelve a suspender las células en medio.
- Filtre la suspensión celular utilizando el colador de células de nylon de 40 μm en un nuevo tubo cónico de 15 ml.
- Mida la señal GFP de las muestras utilizando el citómetro de flujo (realizado por la instalación central de la institución).
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Representative Results
Como representación de nuestro método, realizamos un experimento de EB, NPC y diferenciación neuronal en células E14. Las células E14 se cultivaron en MEFs irradiados γ(Figura 1A)hasta que la población de MEF γ-irradiada se diluyó. Confirmamos la pluripotencia de las células E14 mediante la tinción de fosfatasa alcalina (AP)(Figura 1B)y posteriormente RT-qPCR (ver más abajo) para los marcadores Nanog y Oct4. Las células E14 libres de MEF irradiadas γ fueron inducidas para la diferenciación utilizando el protocolo descrito en la Figura 2A. Brevemente, se sembraron gotas de medios de diferenciación de 20 μL que contenían 500 células en la tapa de la placa de cultivo (ver sección 2 del protocolo para más detalles). Los EB formados se recogieron y se colocaron en suspensión en medios de diferenciación frescos. Desde el día 4 hasta el día 8 de diferenciación, se añadieron 5 μM de AR a las placas de cultivo para inducir NPC. Los EB diferenciados mostraron forma redonda y su tamaño continuó aumentando durante la diferenciación (Figura 2B). En el día 8, los NPC fueron cosechados y tripsinizados, y luego la suspensión unicelular resultante se enchapó en una cámara de cultivo de tejidos en medio DMEM / F12 con suplemento de N2 y más tarde en suplemento de B27. Para el día 10, los NPC que se diferencian en neuronas parecen tener forma de célula alargada(Figura 2B).
Para evaluar aún más nuestro experimento de diferenciación, realizamos experimentos de inmunofluorescencia (IF) en NPC E14 en el día 8 y neuronas E14 en el día 12. Observamos tinción positiva para la nestina en NPCs y señal de neurofilamento (NF) para neuronas (Figura 3A). Alternativamente, RT-qPCR y RNA-seq confirmaron la inducción de genes marcadores NPC y la pérdida de genes de pluripotencia en NPC(Figura 3B, D, F). Como método cuantitativo para probar el éxito de la diferenciación esc, diferenciamos una línea ESC de ratón que expresa un informador GFP9impulsado por el promotor Sox1, seguido de un análisis de citometría de flujo en ESC y NPC. Encontramos que el 58,7% del total de células en la etapa NPC son GFP positivas, mientras que la señal GFP es 0.0% en la etapa ESC(Figura 3C). Para perfilar los cambios transcriptómicos durante la diferenciación, se realizaron experimentos de ARN-seq para E14 ESCs, EB día 3 y NPC día 8 y revelaron grupos de genes asociados con las respectivas etapas(Figura 3D). Los genes en el mapa de calor RNA-seq se ordenaron en función de sus niveles de expresión para identificar genes expresados diferencialmente en las diferentes etapas durante la diferenciación. El análisis de ontología génica (GO) para los cuatro grupos de genes mostró que estos grupos corresponden a distintas funciones o vías celulares, lo que indica que las tres etapas celulares de la diferenciación neuronal mESC tienen cada una un grupo de genes que están altamente expresados en su etapa respectiva, pero no en otras(Figura 3E). Por ejemplo, los genes en el Grupo 3 están altamente expresados en los NPC E14 en comparación con otras etapas y corresponden a vías relacionadas con el desarrollo neuronal. Los grupos 1, 2 y 4 no contienen genes altamente expresados relacionados con ninguna especificación de linaje de la capa germinal, pero están relacionados con el crecimiento y la proliferación celular. Por lo tanto, el RNA-seq y el análisis GO que lo acompaña mostraron que las células E14 se han diferenciado en el linaje neuronal en el día 8 de diferenciación.
Figura 1: E14 CES en la cultura. (A) Las imágenes del microscopio de luz muestran células E14 (flecha negra) creciendo en colonias sobre los MEF irradiados por γ. Las colonias E14 continúan proliferando como se ve en la diferencia de tamaño de la colonia entre las culturas del día 1 y del día 3. (B) Confirmación de la pluripotencia de las ESC E14 por la tinción de fosfatasa alcalina (AP). Las flechas púrpuras indican los mESC que fueron positivos para la tinción AP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diferenciación de E14 en EB, NPC y neuronas. (A) El esquema resume los principales pasos para diferenciar las células E14 en EB, NPC y neuronas. (B) Las ESC E14 cultivadas en medio sin LIF y 2i en una placa de suspensión forman esferas individuales de EB visibles en el día 2, donde continúan creciendo y expandiéndose en tamaño en los días posteriores. La AR se agrega en el día 4 de la diferenciación para inducir la diferenciación en NPC. Después de 4 días de inducción, estos NPC se colocan para su diferenciación en neuronas, que se muestran en el panel inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Caracterización de células diferenciadas. (A) Las imágenes de inmunofluorescencia en el panel superior muestran EB que contienen NPC en el día 8 sondeados para nestina (verde) y núcleos (DAPI, azul). El panel inferior muestra imágenes de inmunofluorescencia para neuronas en el día 12 sondeadas para neurofilamento (verde). El cuadro rojo en las imágenes combinadas se amplía 3x para una mejor vista. (B) Análisis RT-qPCR que muestra los marcadores de pluripotencia (Nanog y Oct4) y los marcadores NPC (Pax6, NeuroD1y Nes) de E14 ESCs y NPCs. Las barras de error son medias ± SD. (C) Las células E14 que expresan un informador GFP impulsado por el promotor Sox1 se diferenciaron en NPC. Tanto los ESC como los NPC en el día 8 se cuantificaron para la señal fluorescente GFP positiva con citometría de flujo. (D) El mapa de calor muestra las puntuaciones z para el FPKM determinado de los genes expresados en las etapas ESC, EB y NPC. Se identificaron cuatro grupos de genes distintos que significan grupos de genes que se expresan diferencialmente en la etapa ESC, EB o NPC. (E) El análisis go se realizó utilizando el paquete R, clusterProfiler, en los cuatro grupos identificados en el RNA-seq. (F)El gráfico muestra los valores de FPKM para otros tres marcadores de pluripotencia, Sox2, Klf4y Myc, así como marcadores neuronales, NeuN, Map2y Tubb3 para células E14 en las etapas ESC, EB día 3 y NPC día 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método para la diferenciación neuronal de las células madre embrionarias de ratón se ha establecido durante décadas y los investigadores han seguido modificando los protocolos anteriores o creando otros nuevos para diversos fines7,10,11. Utilizamos una serie de ensayos para analizar exhaustivamente la eficiencia y el progreso de las etapas de diferenciación de las mESCs a las neuronas, que pueden usarse en el análisis de otra diferenciación de linaje de ESCs de ratón o humano. Además, nuestros enfoques han demostrado ser herramientas útiles para evaluar el impacto de genes o vías específicas en la diferenciación neuronal in vitro8.
Con nuestros métodos, las ESC pluripotentes no comprometidas tratadas con ácido retinoico (AR) se comprometen con el linaje neuronal con una alta eficiencia y se inducen además a generar neuronas7. Para mejorar la diferenciación exitosa de las células ES en células neurales y reducir la heterogeneidad, es importante mantener las células ES en un estado indiferenciado12. Los MEF no proliferativos, tratados con γ-irradiación o mitomicina C, funcionan para mantener la pluripotencia de los ESC y proporcionan un andamio para su crecimiento13,14. Para obtener resultados consistentes, iniciamos cada experimento de diferenciación con mESCs cultivados en MEFs γ-irradiados. Después de unos pocos pasajes, los MEF irradiados por γ se extinguen y el cultivo finalmente se vuelve homogéneo para las células mESC. Alternativamente, las mESC se pueden pre-enchapar en gelatina durante aproximadamente 45 minutos antes de que se siembren los MEF irradiados con γ para eliminarlos mejor en el siguiente pasaje. El factor inhibidor de la leucemia (LIF) se ha utilizado durante mucho tiempo para mantener el estado de pluripotencia de las células ES de ratón cultivadas mediante la activación de la vía JAK/STAT15,16,17. Más recientemente, se encontró que PD0325901 (PD, un inhibidor de MEK) y CHIR99021 (CH, un inhibidor de GSK) proporcionan un mantenimiento adicional de la pluripotencia de las células ES3,18. En nuestro protocolo, cultivamos mESCs con estos inhibidores junto con LIF para mantener una alta pluripotencia de mESCs.
Otro factor crítico para lograr una diferenciación exitosa es la calidad de los EB. Realizamos la diferenciación de células E14 por el método de la gota colgante, que ha sido aplicado por otros investigadores5,19,20. Con este método, se permite que las células ES individuales se suspendan en la gota del medio de diferenciación durante 2 días, donde se agregan espontáneamente y forman EB. Los EB resultantes suelen estar más bien definidos en términos de sumorfología (Figura 2B)en comparación con el método de suspensión de mESC aislados en medio, lo que resulta en tamaños de EB en un rango mucho más amplio en nuestra experiencia (datos no mostrados). Para evitar que los EB se adhieran a las placas, es importante hacer una rotación a baja velocidad a partir del día 3 continuando a través del proceso de diferenciación. Los EB son inducidos a diferenciarse en NPC tratándolos con AR. Los NPC resultantes del tratamiento con AR en el día 4 de eb son típicamente heterogéneos para células neurales como oligodendrocitos y astrocitos21. Usando RT-qPCR o inmunofluorescencia, la población de NPC puede ser sondeada en busca de marcadores neuronales y otros marcadores de linaje neural como Gfap para astrocitos y Olig2 para oligodendrocitos. Para inducir aún más la diferenciación de los NPC en neuronas, los NPC se cultivan en un medio neuronal óptimo donde los componentes más importantes son los suplementos de N2 y B27. El suplemento N2 funciona principalmente para ayudar a los NPC a comprometerse con el linaje neuronal, mientras que el suplemento B27 funciona para mantener la longevidad de las neuronas.
Las muestras se pueden recolectar a lo largo del período de diferenciación (por ejemplo, etapa ESC, eb día 2, EB día 4, NPC día 6, NPC día 8, neuronas día 10 y neuronas día 12) para rastrear el proceso de diferenciación mediante la realización de RT-qPCR para marcadores de pluripotencia y ectodermo. Comparando los marcadores de pluripotencia como Oct4, Nanog, Sox2, Klf4y Myc entre las diferentes etapas celulares se verificará la pluripotencia de los mESCs(Figura 3B,F). Investigar la eficiencia de la diferenciación neuronal, marcadores para la capa de mesodermo como Hand1, Snai1y Tbxt; y la capa de endodermo como Eomes y Gata4 también se puede sondear (datos no mostrados). Se puede realizar una verificación adicional con sondeo de inmunofluorescencia (IF) para NPC o marcadores neuronales(Figura 3A). Sin embargo, estos métodos no son cuantitativos y están sesgados hacia los marcadores seleccionados. Para superar estas limitaciones, incorporamos citometría de flujo y análisis de ARN-seq (Figura 3C\u2012F). La línea celular utilizada en el experimento de citometría de flujo es una línea celular Sox1-GFP E14, que se utilizó específicamente en este experimento para evaluar la calidad del procedimiento de diferenciación de NPC. Sox1 es uno de los primeros marcadores neuronales específicos durante el desarrollo del neuroectodermo22, por lo que es un excelente marcador para el linaje de NPC. Sox1 puede ser sondeado para usar RT-qPCR o Western blot para evaluar la población de NPC. Estos análisis son particularmente beneficiosos para investigar el defecto de diferenciación causado por la manipulación de genes o el tratamiento químico.
Es importante tener en cuenta que hay algunas limitaciones a nuestro protocolo presentado aquí. En primer lugar, solo estamos presentando el análisis exhaustivo para una línea celular mESC de tipo salvaje. Otras líneas ESC que se originan en ratones o humanos pueden requerir cambios y una mayor optimización en el protocolo para garantizar una diferenciación neuronal exitosa y eficiente. En segundo lugar, presentamos un método de diferenciación neuronal in vitro, que naturalmente tiene su propio conjunto de limitaciones. Como se mencionó anteriormente, los EB se tratan con un nivel suprafisiológico de AR para conducirlos hacia el linaje NPC. Los NPC resultantes se colocan en medios óptimos para imitar las condiciones fisiológicas y fomentar el compromiso, el crecimiento y la longevidad del linaje neuronal. Aquí, los suplementos de N2 y B27 se utilizan para cultivar neuronas, pero también están disponibles otros suplementos como NS2123 para fines similares, lo que puede alterar el éxito y la eficiencia de la diferenciación neuronal. Estas condiciones se reconstituyen sintéticamente en los ensayos de cultivo celular, que pueden no representar completamente las condiciones fisiológicas. La calidad de los EB, NPC y neuronas depende en gran medida de las mESC iniciales. Las mESC que se han pasado demasiadas veces y se han mantenido en cultivo durante más de 1 semana generalmente comienzan a perder pluripotencia y pueden no experimentar con éxito la diferenciación. Por lo tanto, mantener las mESC en una condición óptima es clave para garantizar que puedan diferenciarse efectivamente en EB, NPC y neuronas. También se han propuesto otros métodos de cultivo de neuronas, como los modelos 3D, para imitar mejor las condiciones fisiológicas24,25,26 a veces a expensas del rendimiento y la viabilidad27,28. Creemos que nuestros protocolos son útiles para caracterizar estos modelos de cultivo 3D.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH (1R35GM133496-01) a Z. Gao. Nos gustaría agradecer al Dr. Ryan Hobbs por la asistencia en la sección. Agradecemos las instalaciones centrales de Penn State College of Medicine, incluidas las Ciencias del Genoma y la Bioinformática, las Imágenes Avanzadas de Microscopía de Luz y la Citometría de Flujo. También agradecemos a la Dra. Yuka Imamura por la asistencia en el análisis de ARN-seq.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| - Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| - Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| - Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| - Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
References
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