Differensiering og karakterisering av nevrale forfedre og nevroner fra musens embryonale stamceller

Summary

Vi beskriver prosedyren for in vitro differensiering av musen embryonale stamceller i nevronale celler ved hjelp av hengende dråpemetode. Videre utfører vi en omfattende fenotypisk analyse gjennom RT-qPCR, immunfluorescens, RNA-seq og strømningscytometri.

Abstract

Vi beskriver den trinnvise prosedyren for dyrking og differensiering av museembreniske stamceller i nevronale avstamninger, etterfulgt av en rekke analyser for å karakterisere de differensierte cellene. E14-musens embryonale stamceller ble brukt til å danne embryoide kropper gjennom den hengende dråpemetoden, og deretter indusert til å skille seg ut i nevrale stamceller ved retinoinsyre, og til slutt differensiert til nevroner. Kvantitative omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) og immunfluorescenseksperimenter viste at nevrale forfedre og nevroner viser tilsvarende markører (nestin for nevrale forfedre og nevrofilament for nevroner) på henholdsvis dag 8 og 12 postdifferensiering. Flow cytometrieksperimenter på en E14-linje som uttrykker en Sox1 promotordrevet GFP-reporter viste at omtrent 60% av cellene på dag 8 er GFP-positive, noe som indikerer vellykket differensiering av nevrale stamceller på dette stadiet. Til slutt ble RNA-seq-analyse brukt til å profilere de globale transkripsjonsendringene. Disse metodene er nyttige for å analysere involvering av spesifikke gener og veier for å regulere celleidentitetsovergangen under nevronal differensiering.

Introduction

Siden deres første avledning fra den indre cellemassen til de utviklende mus blastocystene^1,2, har musens embryonale stamceller (mESC) blitt brukt som kraftige verktøy for å studere stamcelle selvfornyelse og differensiering³. Videre fører studier av mESC-differensiering til enorm forståelse av molekylære mekanismer som kan forbedre effektiviteten og sikkerheten i stamcellebasert terapi ved behandling av sykdommer som nevrodegenerative lidelser⁴. Sammenlignet med dyremodeller gir dette in vitro-systemet mange fordeler, inkludert enkelhet i praksis og vurdering, lave kostnader ved å opprettholde cellelinjer i motsetning til dyr, og relativt enkel i genetiske manipulasjoner. Effektiviteten og kvaliteten på differensierte celletyper påvirkes imidlertid ofte av forskjellige linjer med MESCer samt differensieringsmetodene^5,6. De tradisjonelle analysene for å evaluere differensieringseffektivitet er også avhengige av kvalitativ undersøkelse av utvalgte markørgener som mangler robusthet, og de klarer derfor ikke å forstå globale endringer i genuttrykk.

Her tar vi sikte på å bruke et batteri av analyser for systematisk vurdering av nevronal differensiering. Ved hjelp av både tradisjonelle in vitro-analyser på utvalgte markører og RNA-seq etablerer vi en plattform for måling av differensieringseffektivitet samt transkripsjonsendringer under denne prosessen. Basert på en tidligere etablert protokoll⁷genererte vi embryoide legemer (EBs) gjennom hengende dråpeteknikk, etterfulgt av induksjon ved hjelp av stikkfysiologiske mengder retinoinsyre (RA) for å generere nevrale stamceller (NPCer), som senere ble differensiert til nevroner med nevral induksjonsmedium. For å undersøke effektiviteten av differensiering, i tillegg til tradisjonelle RT-qPCR og immunfluorescence (IF) analyser, utførte vi RNA-seq og strømningscytometri. Disse analysene gir omfattende måling av progresjonen av den scenespesifikke differensieringen.

Protocol

1. mESC kultur Belegge en 10 cm vevskulturbehandlet plate med 0,1% gelatin og la gelatinet sette i minst 15-30 min før du aspirerer det ut. Frø γ bestrålet mus embryonale fibroblaster (MEF-er) en dag før kultivering av mESC i det forvarmede mESC-mediet (Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) med 15% fosterbovinserum (FBS), ikke-essensielle aminosyrer, β-mercaptoetanol, L-glutamin, penicillin/streptomycin, natriumpyuvatt, LIF, PD0325901 (PD) og Chir99021 (CH)). La de γ bestrålede M…

Representative Results

Som en representasjon av vår metode utførte vi et EB-, NPC- og neurondifferensieringseksperiment på E14-celler. E14-celler ble dyrket på γ-bestrålede MEF-er (figur 1A) til den γ bestrålede MEF-populasjonen ble fortynnet. Vi bekreftet pluripotensen til E14-cellene ved å utføre alkalisk fosfatase (AP) farging (figur 1B) og senere RT-qPCR (se nedenfor) for Nanog- og Okt4-markører. De γ utstrålede MEF-frie E14-cellene ble deretter indu…

Discussion

Metoden for nevral differensiering av musens embryonale stamceller har blitt etablert i flere tiår, og forskere har fortsatt å endre de tidligere protokollene eller lage nye for ulike formål^7,10,11. Vi benyttet en rekke analyser for å analysere effektiviteten og fremdriften av differensieringsstadiene av mESC til nevroner, som kan brukes til analyse av annen avstamningsdifferensiering av mus eller menneskelige ESCer. Videre …

Materials

0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X	Corning	25-052-CV
0.1% Gelatin	Sigma	G1890-100G	Prepared in de-ionized water
16% Paraformaldehyde	Thermo Scientific	28908	Diluted in 1X PBS
40-μm cell strainer	Falcon	352340
Albumax	Thermo Fisher Scientific	11020021
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11001	Antibody was diluted at 1:500 for IF
Alkaline Phosphatase Staining Kit II	Stemgent	00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox	Azura Genomics	AZ-2105
B27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSCanto	BD	657338
bFGF	Sigma	11123149001
BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit	Agilent	5067-4626
Chir99021	Cayman Chemicals	13122
Chloroform	C298-500	Fisher Chemical
DAPI	Invitrogen	R37606
DMEM	Corning	10-017-CM
DMEM/F12 medium	Thermo Fisher Scientific	11320033
EB buffer	Qiagen	19086
Ethanol	111000200	Pharmco	Diluted in de-ionized water
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S10250
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
HiSeq 2500 Sequencing System	Illumina	SY-401-2501
Isopropanol	BDH1133-4LG	BDH VWR Analytical	Diluted in de-ionized water
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030024
LIF	N/A	N/A	Collected from MEF supernatant
m18srRNA primers	IDTDNA	N/A	5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'
MEM Non-essential amino acids	Corning	25-025-Cl
mNanog primers	IDTDNA	N/A	5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes primers	IDTDNA	N/A	5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'
mNeuroD1 primers	IDTDNA	N/A	5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'
mOct4 primers	IDTDNA	N/A	5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'
mPax6 primers	IDTDNA	N/A	5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'
N2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin primary antibody	Millipore	MAB5326	Antibody was diluted at 1:200 for IF
Neural basal	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilament primary antibody	DSHB	2H3
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit	BioO Scientific	NOVA-5138-07
PD0325901	Cayman Chemicals	13034
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	Prepared in de-ionized water
– Potassium chloride	P217-500G	VWR
– Potassium phosphate monobasic anhydrous	0781-500G	VWR
– Sodium chloride	BP358-10	Fisher Bioreagents
– Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate	SX0715-1	Milipore
Random hexamer primer	Thermo Scientific	SO142
Retinoic acid	Sigma	R2625	Prepared in DMSO
Sodium pyruvate	Corning	25-000-Cl
Sucrose	Sigma	84097	Diluted in 1X PBS
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064022
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura	4583
TriPure Isolation Reagent	Sigma-Aldrich	11667165001
TruSeq Rapid	Illumina	20020616
β-mercaptoethanol	Fisher BioReagents	BP176-100