Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка фагоцитарных свойств микроглии и макрофагов головного мозга может обеспечить ценный функциональный аспект для исследований молекулярного профилирования. Мы описываем валидированный протокол, в котором проточная цитометрия используется для быстрой и надежной количественной оценки фагоцитоза флуоресцентных микросфер и бета-амилоидных фибрилл с помощью остро изолированной микроглии и макрофагов мозга из мышиных моделей.
Микроглия и инфильтрирующие центральную нервную систему (ЦНС) макрофаги, называемые мононуклеарными фагоцитами ЦНС (ЦНС-МП), играют центральную роль при неврологических заболеваниях, включая нейродегенерацию и инсульт. ЦНС-МП участвуют в фагоцитарном клиренсе патологических белков, мусора и нейрональных синапсов, каждый из которых имеет различные молекулярные пути. Характеристика этих фагоцитарных свойств может обеспечить функциональное считывание, которое дополняет молекулярное профилирование микроглии с использованием традиционных подходов проточной цитометрии, транскриптомики и протеомики. Фагоцитарное профилирование микроглии основывалось на микроскопической визуализации и культурах in vitro неонатальной микроглии мышей. Первый подход страдает от ограниченной выборки, в то время как второй подход по своей сути плохо отражает истинное состояние in vivo взрослых ЦНС-МП. В данной работе описаны оптимизированные протоколы фенотипа фагоцитарных свойств остро изолированных ЦНС-МП мышей методом проточной цитометрии. ЦНС-МП остро выделяют из мозга взрослой мыши с помощью механической диссоциации с последующей центрифугированием градиента плотности, инкубируют с флуоресцентными микросферами или флуоресцентными Aβ-фибриллами, промывают и затем мечут панелями антител против поверхностных маркеров (CD11b, CD45). Используя этот подход, можно сравнить фагоцитарные свойства резидентной микроглии головного мозга с макрофагами, инфильтрирующими ЦНС, а затем оценить влияние старения и патологии заболевания на эти фагоцитарные фенотипы. Этот быстрый метод также обладает потенциалом для функционального фенотипирования остро изолированных ЦНС-МП человека из посмертных или хирургических образцов мозга. Кроме того, специфические механизмы фагоцитоза субпопуляциями ЦНС-МП могут быть исследованы путем ингибирования отдельных фагоцитарных путей.
Клетки врожденного иммунитета центральной нервной системы (ЦНС) в основном состоят из микроглии и инфильтрирующих моноцитов/макрофагов, называемых мононуклеарными фагоцитами ЦНС-МНП (ЦНС-МП)1. МП ЦНС связаны с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера (БА), нейровоспалительные расстройства и инсульт 2,3,4. ЦНС-МП, наряду с астроцитами, перицитами и эпендимальными клетками, обладают фагоцитарными функциями 5,6. В своем гомеостатическом с....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все исследования на мышах проводились после получения одобрения от Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Эмори и в строгом соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения.
1. Подготовка в день изоляции
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Для иллюстрации типичных результатов фагоцитарного поглощения микросфер и фибрилл Aβ42 остроизолированными ЦНС-МП были получены остроизолированные ЦНС-МП из ипсилатерального полушария после транзиторной окклюзии средней мозговой артерии (ОКАО)8. Для получения подробной информации о фагоцитарных свойствах ЦНС-МП в модели MCAO, пожалуйста, обратитесь к предыдущим публикациям8. Вкратце, после 72-часового восстановления МП ЦНС были остро выделены из свежего мозга с помощью меха.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Проточная цитометрия — это метод, который может обнаруживать экспрессию белков или маркеров, представляющих интерес, на поверхности клетки или во внутриклеточных компартментах с помощью флуоресцентно меченых зондов (обычно антител) для обозначения этих представляющих интерес маркеров. Антитела клеточной поверхности или внутриклеточные антитела обычно конъюгированы с возбуждаемыми лазером флуорохромами, которые имеют уникальные эмиссионные спектры. Клетки, инкубированные с этими антителам.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторам нечего раскрывать.
Исследование было поддержано наградами NIH доктору Рангараджу (NINDS K08 NS099474-1 и R01 NS114130-01A1) и доктору Раяпролу (NIA F32AG064862). Это исследование было частично поддержано Emory Flow Cytometry Core (EFCC), одним из Emory Integrated Core Facility (EICF) и субсидируется Медицинской школой Университета Эмори. Дополнительная поддержка была оказана Альянсом клинических и трансляционных наук Джорджии NIH (UL1TR002378). Ответственность за содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения NIH.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10x сбалансированный раствор соли Хэнка (10x HBSS) | ThermoFisher | 14065056 | хранения при 4 °C. Используется для приготовления SIP, как описано в протоколе |
| 1x сбалансированный раствор соли Хэнка (1x HBSS) | ThermoFisher | 14175095 | хранить при 4 °C. Используется для получения 35% SIP, как описано в протоколе |
| 1x Фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS) | https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html Храните 10xPBS при комнатной температуре. Приготовьте свежий 1xPBS, разбавив одну часть 10xPBS до девяти частей MilliQ dH20 и храните его при температуре 4 °°; C за час до использования. Перед охлаждением убедитесь, что pH 1xPBS составляет 7,0. | ||
| 35% SIP | Чтобы сделать 20 мл 35% SIP, используйте 7 мл SIP и 13 мл ice-cold 1 раз; HBSS. Держать на льду до дальнейшей обработки | ||
| APC-Cy7 крысы анти-CD11b | BD Pharmingen | 557657 | Хранить при 4° C или держать на льду во время использования. Шилд от света. Разведение проточной цитометрии - 1:100 |
| FITC rat anti mouse CD145 | BD Pharmingen | 553080 | Хранить при 4 ° C или держать на льду во время использования. Шилд от света. Разведение проточной цитометрии - 1:100 |
| ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ Исправляемый набор для окрашивания синими мертвыми клетками | ThermoFisher | L34961 | Хранить при -20 °C. Добавьте 50 мкл ДМСО в одну пробирку с красителем, сделайте вихрь и центрифугируйте на максимальной скорости в течение 1 мин. Сделайте 10&м; L аликвоты и храните их при -20 °C. Используйте свежую аликвоту для каждого эксперимента и добавляйте в образцы в разведении 1:500. |
| OneComp eBeads компенсационные бусины | ThermoFisher | 01-1111-42 | Магазин по адресу 4 ° C, тщательно промотать пробирку перед добавлением в пробирку (пробирки) с образцом, держать на льду во время использования. |
| PE-Cy7 крысиный антимышиный CD145 | BD Pharmingen | 552848 | хранить в 4 ° C или держать на льду во время использования. Шилд от света. Разведение проточной цитометрии - 1:100 |
| Percoll pH8.5-9.5 | Sigma | P1644 | Хранить при 4°C. Чтобы сделать 10 мл стандартного изотонического Percoll (SIP): используйте 9 мл холодного Percoll и 1 мл холодного 10 раз; HBSS. |
| Фикоэритрин-конъюгированные микросферы | ThermoFisher | F13083 | хранятся при температуре 4° C или держать на льду во время использования. |
| β-амилоид (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - меченый, Human | AnaSpec | AS-60479-01 | Конечная концентрация Ab фибрилл составляет 200&микро; M, который затем разбавляется перед использованием. Хранить при -20 °C. Готовьте свежий рабочий раствор для каждого эксперимента. |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно