Transkriptomik Profilleme için İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin ve CD4 + T hücrelerinin Sézary Sendromu Hastalarından İzole Edilmesi

Summary

Periferik kan mononükleer hücrelerinin Sézary Sendromu tanısı alan hastalardan elde edilen tam kandan izole edilmesi, ardından CD4 + T hücrelerinin seçimi, forbol12-miristat13-asetat ve A23187 iyonofor ile uyarılmaları ve transkriptomik profilleme için RNA’nın hazırlanması için basit bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Kutanöz T hücreli lenfomalar (KTHL), olgun cilde ev sahipliği yapan T hücrelerinin transformasyonu ve kontrolsüz proliferasyonundan kaynaklanır ve mikozis fungoides (MF) ve Sézary sendromu (SS) en sık görülen alt tipleri temsil eder. KTHL’nin gen ekspresyonu, genetik değişiklikleri ve epigenetik anormalliklerini karakterize eden bir dizi çalışmaya rağmen, MF / SS’nin moleküler patogenezi belirsizliğini korumaktadır. MF, deri baskınlığı olan daha yaygın KTHL’yi ifade eder ve genellikle deri ile sınırlıdır, oysa SS, yaygın cilt tutulumu olan ve esas olarak kan, deri ve lenf nodunu içeren neoplastik dağılım ile karakterize agresif bir lösemik BT varyantıdır. Klinik uygulamaya odaklanıldığında, gen ekspresyonu biyobelirteçlerinin tanımlanması, MF / SS’nin tanı ve tedavisini iyileştirmek için muazzam bir potansiyele sahiptir. Gerçekten de, son transkriptomik çalışmalar, normal ve malign T hücreleri arasındaki gen ekspresyonundaki farklılıklardan potansiyel tanısal biyobelirteçleri tanımlamıştır, bu da SS biyolojisi hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir ve potansiyel terapötik hedefleri ortaya çıkarabilir. Bu yazıda, SS tanısı alan hastalardan taze tam kandan periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu, CD4+ bellek T hücrelerinin (CD4+CD45RO+T hücreleri) seçimi, kimyasal stimülasyon ve hastalık etiyolojisinde ek içgörü kazanmak üzere yeni prognostik moleküler belirteçleri keşfetmek üzere transkriptomik profillemeye uygun RNA’nın hazırlanması için ayrıntılı bir tekrarlanabilir protokol anlatılmaktadır. Nükleer regülasyonu aktive etmek için kimyasal agonist kullanılarak yapılan stimülasyon, dinamik transkripsiyon regülasyonu ve gen ekspresyonunda önemli olan yollar için daha spesifik bir değerlendirme sağlar ve hücre zarındaki TCR antijen kaybından kaynaklanan yukarı akış sinyal kusurlarından kaynaklanabilecek kafa karıştırıcı kusurları ortadan kaldırır. Uyarılmamış SS T hücrelerinin transkriptomunun karşılaştırılmasından elde edilen veriler, sessiz uyarılmamış hücrelerin analizinden belirgin olmayan fonksiyonel düzenleyici gen ekspresyon kusurlarının maskesini düşürmektedir. Ayrıca, bu yaklaşımdan özetlenen yöntem, diğer T hücresi bağışıklık hastalıklarında T hücresi gen ekspresyon kusurlarını incelemek için uyarlanabilir.

Introduction

En sık görülen alt tipler mikozis fungoides (MF) ve Sézary sendromu (SS) dahil olmak üzere kutanöz T hücreli lenfoma (KTHL), olgun cilt homing T hücrelerinin transformasyonu ve kontrolsüz proliferasyonundan kaynaklanan heterojen bir hastalık grubudur ^1,2. Neoplastik T hücreleri olgun CD4 + CD45RO +, bellek fenotipi^3’e sahiptir ve özellikle erken hastalıkta döküntü olarak ortaya çıkan epidermotropizmi^4’ü artıran deri homing adezyon belirteçlerini eksprese eder. MF’nin klinik seyri, rutin yönetilen bakım altındayken genellikle tembeldir, ancak hastaların bir alt kümesi daha ileri hastalığa ilerleyebilir. Bu MF vakalarında, deri lezyonları büyür ve kalınlaşarak büyük tümörlere dönüşür ve neoplastik T hücreleri lenf düğümlerine ve viseral organlara yayılabilir. Buna karşılık, SS, CTCL^5’in daha agresif, lösemik bir varyantıdır ve bir semptom üçlüsü ile karakterizedir: jeneralize eritroderma (toplam vücut yüzey alanının% >80’ini etkileyen olarak tanımlanır), lenfadenopati ve Sézary hücreleri olarak adlandırılan serebriform çekirdekli 1000 /^mm3’ten fazla dolaşımdaki klonal atipik T hücrelerinin varlığı ^6,7 . SS hastalarının prognozu MF’den anlamlı derecede kötüdür. SS, 0.1/100.000 insidans oranı ile nadirdir ve toplam KTHL vakalarının yaklaşık% ^3’ünü temsil eder^8,9. CTCL tipik olarak yaşlı erişkinlerde ortanca yaşı yaklaşık 60 yıl¹⁰ olan kişilerde ortaya çıkar. KTHL insidansı artmaktadır ve nedeni belirsiz olsa da, oran 1998’den beri stabilize olmuştur^11,12.

SS’nin moleküler patogenezi belirsizliğini korumaktadır. Genetik, epigenetik ve gen ekspresyon çalışmaları çok sayıda yeni veri üretmiştir, ancak öncelikle incelenen küçük hasta kohortları^2’nin yanı sıra deneysel tasarım ve kontrol popülasyonlarındaki farklılıklar nedeniyle tutarsız bulgular kalmıştır^13,14. Geliştirilmiş genomik ve transkriptomik karakterizasyon, hem hastalık mekanizmalarına hem de daha önce keşfedilmemiş terapötik hedeflere ışık tutabilir. Bu nedenle, bu heterojen maligniteyi daha iyi anlamak için daha geniş bir hasta popülasyonundan daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Bir SS kohortunda oldukça hassas ve spesifik olan biyobelirteç panelleri, SS¹⁶ için güvenilir tanısal ve prognostik biyobelirteçlerin geliştirilmesinde ciddi bir engel teşkil eden diğer kohortlarda^15’te daha az düzgün performans göstermiştir. İdeal tanısal biyobelirteçler, malign T hücrelerinde tutarlı ve yüksek oranda aşırı eksprese edilirken, normal T hücrelerinde yoktur veya neredeyse yoktur¹⁷. Hastalığa özgü biyobelirteçlerin keşfi, SS için tanı ve tedavi protokollerinin geliştirilmesi açısından önemlidir.

Hem malign hem de normal T hücreleri için yüksek kaliteli transkriptomik veriler, numune hazırlamada etkili ve güvenilir bir yaklaşım gerektirir. Burada, SS ile ilgili T hücre popülasyonlarından RNA örnekleri elde etmek için ayrıntılı ama basit bir stratejiyi tartışacağız. Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) tam kandan izolasyonu, hastalıkla ilgili CD4 + CD45RO + T hücre popülasyonlarının negatif manyetik seçimi, fonksiyonel yanıtlardaki farklılıkları ortaya çıkarmak için kimyasal aktivasyon ve transkriptomik profilleme için RNA’nın hazırlanması tartışılacaktır. Mevcut protokolde, forbol miristat asetat (PMA) ve kalsiyum iyonofor (A23187)^18,19 kullanılarak kimyasal aktivasyon gerçekleştirilmiştir, çünkü önceki çalışmalar CTCL’de kusurlu T hücresi reseptör sinyallemesi olduğunu göstermiştir ve PMA / A23187 ile stimülasyon, T hücresi reseptörü^20,21’i atlar. Ayrıca, PMA / A23187, sitokin gen aktivasyonu için gerekli olan nükleer sinyallerin daha doğrudan proksimal aktivasyonuna izin verir. Son olarak, T hücrelerinin uyarılması, dinamik değişimin olmadığı dinlenme T hücrelerinden elde edilemeyen gen ekspresyonunun düzenlenmesi hakkında ek bir fikir seviyesi sağlar.

Protocol

İnsan hücreleri potansiyel olarak bulaşıcıdır. Bu nedenle, deneyler kesinlikle iş sağlığı ve güvenliği yönetimi (OSHA) ve kişisel koruma ekipmanları (KKD) olarak tartışılan gerekli önlemler ve prosedürlere uygun olarak gerçekleştirilir. 1. PBMC’lerin tam kandan izolasyonu Tablo 1’den ihtiyaç duyulan tüm malzemeleri toplayın ve oda sıcaklığına (RT) getirin. Sıcak RP10F ila 37 °C. Santrifüjlemeler ve hücre sayımı dışında, biyolojik bir güvenlik kabinindeki canlı hücreleri kullanarak tüm adımları gerçekleştirin. Antikoagülan içeren beş adet 10 mL tüpte (istenilen miktarda) kan elde edin. Tam kanı ortam sıcaklığında (18\u201224 °C) saklayın. 50 mL ayırma tüplerini, işlenecek kan örneği için insan araştırma konusu numarası ile etiketleyin. 10\u201215 mL kanı eşleşen denek numarasıyla her bir ayırma tüpüne aktarın. Kanı Hank’in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile en az 2 kat seyreltin. Tüp başına 35 mL seyreltilmiş kanı aşmayın. Kanı ~ 13 mL yoğunluk ortamı ile dikkatlice ve yavaşça alttan yerleştirin. Tüpün altındaki saydam yoğunluk ortamını izleyin ve pipet neredeyse boşken pipetlemeyi durdurun (kabarcık salınımını önlemek için). Kan ve yoğunluk orta tabakalarının karışmasını önlemek için pipeti dikkatlice çıkarın. Doldurulmuş ayırma tüplerini, katmanları rahatsız etmeden dikkatlice santrifüje aktarın. Santrifüj freni kapalıyken 30 dakika boyunca 500 x g’de santrifüj yapın (yavaşlama sıfıra ayarlandı).NOT: Santrifüjde yalnızca rpm görüntüleniyorsa, 500 x g için rpm eşdeğerini tahmin etmek üzere rotor teknik özelliklerine bakın. Ayırma tüplerini, katmanları rahatsız etmeden santrifüjden dikkatlice çıkarın. Yoğunluk ortamı ve plazma katmanları arasında oluşan kabarık kaplamayı gözlemleyin. Üst plazma fraksiyonunun çoğunu çıkarmak ve atmak için üstten pipet, böylece buffy katın üzerinde 10 mL kalır. Buffy paltoyu dikkatlice ve yavaşça toplayın. Buffy katları iki ayırma tüpünden Şekil 1’de gösterildiği gibi önceden etiketlenmiş ve steril yeni bir 50 mL tüpe aktarın. PBMC’leri HBSS ile en az 2 kat seyrelterek her yeni tüpteki hacmi 50 mL’ye çıkarın. Santrifüj frenini tam olarak değiştirmeyi unutmayın. Pelet PBMC’leri 10 dakika boyunca 400 x g’de santrifüjleme ile. Süpernatantı mümkün olduğunca çıkarın ve peleti gevşetmek için tüpün dibine dokunun. Artık kırmızı kan hücrelerini (RBC) lize etmek için, her hücre peletini 10 mL orijinal kan hacmi başına 1\u20122 mL amonyum-klorür-potasyum (ACK) lizis tamponunda yeniden askıya alın. Tam olarak 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Eşit veya daha büyük bir HBSS hacmiyle lizizi derhal durdurun ve ses seviyesini 50 mL’ye ayarlayın. 10 dakika boyunca 400 x g’de santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini gevşetmek için tüpün dibine dokunun. Aynı donörden havuz hücreleri. HBSS ile 50 mL’ye kadar ses getirin. 10 dakika boyunca 400 x g’de santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini gevşetmek için tüpün dibine dokunun. Hücreleri 10 mL sıcak RP10F ortamında yeniden askıya alın ve tripan mavisi kullanarak canlı hücre sayımı için bir aliquot alın. Bir hemositometre kullanarak her numunedeki toplam hücre sayısını hesaplayın. 2. CD4 + CD45RO + T hücrelerinin PBMC’lerden saflaştırılması NOT: CD4 + CD45RO + T hücrelerinin PBMC’lerden saflaştırılması, küçük değişikliklerle ticari olarak temin edilebilen manyetik ayırma (bkz. Her ticari kitin kendi talimatları olduğu için kuluçka süresi için kit kılavuzunu takip etmek tercih edilir. İstenilen miktarda PBMC’yi 10 mL seçim tamponunda yıkayın. 10 dakika boyunca 400 x g’de santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve peleti gevşetmek için tüpün dibine dokunun. PBMC’leri seçim tamponunda 5 x 107 hücre/mL’ye kadar seyreltin ve 5 mL’lik polistiren yuvarlak tabanlı tüpe (12 x 75 mm) aktarın. 1 mL numune başına 50 μL antikor kokteyli ekleyin ve yavaşça karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Kullanımdan hemen önce, yüksek hızda 30 saniye boyunca vorteks manyetik parçacıkları. PBMC’leri içeren tüpe 1 mL numune başına 50 μL manyetik parçacık ekleyin ve yavaşça karıştırın. Seçim tamponu ile hacmi 2,5 mL’ye kadar çıkarın ve nazikçe karıştırın. Tüpü (kapaksız) mıknatısa yerleştirin ve RT’de 2,5 dakika inkübe edin. Mıknatısı alın ve sürekli bir hareketle, zenginleştirilmiş hücre süspansiyonunu yeni bir steril tüpe dökmek için mıknatısı ve tüpü ters çevirin. Geri kazanımı artırmak için, hareketsiz boncukları rahatsız etmeden mıknatısta kalan tüpe 2,5 mL seçim tamponu ekleyin. Mıknatısta 2,5 dakika daha tutun ve ek hücreleri kurtarmak için adım 2,6’yı tekrarlayın. Tripan mavisi kullanarak canlı hücre sayımı için bir aliquot alın. Bir hemositometre veya hücre sayacı kullanarak toplam hücre sayısını hesaplayın. Saflığı akış sitometrisi ile onaylayın (Şekil 3). 3. Kimyasal aktivasyon CD4 + CD45RO + T hücrelerini sıcak RP10F ortamıyla 5 x 106 hücre / mL’ye ayarlayın ve hücreleri istenen boyuttaki kültür tabaklarına dağıtın. Nemlendirilmiş 37 °C %5 CO2 inkübatöründe gece boyunca dinlenme hücreleri. Pelet dinlenmiş hücreler 400 x g’da 10 dakika boyunca santrifüjleme ile. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini gevşetmek için tüpün dibine dokunun. Sıcak RP10F ortamıyla hücre konsantrasyonunu 5 x 106 hücre/mL’ye ayarlayın ve üç steril, vidalı kapaklı tüpün her birine 0,5\u20121 x 107 hücre dağıtın.NOT: Yeterli hücre varsa, deneysel tasarıma yinelenen stimülasyonlar veya ek zaman noktaları dahil edilebilir. PMA ve A23187 ile tüp 2 ve 3’teki hücreleri uyarın. PMA’yı 25 ng / mL’ye ve A23187’yi 500 ng / mL’ye ekleyin ve yavaşça karıştırın. Tüp 1’deki hücrelere eşit miktarda dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin ve bu hücreler bir araç (kontrol) görevi görür. Örneğin, 1 μL PMA ve 1 μL A23187 kullanıyorsanız, araç tüpüne 2 μL DMSO ekleyin. DMSO’nun son konsantrasyonunu tüm tüplerde% 0.5’in altında tutun. Tüplerin üzerindeki kapakları gevşetin ve hücreleri 2 saat (tüp 2) ve 6 saat (tüp 1 ve 3) için 37 ° C% 5 CO2 inkübatöre geri döndürün. Belirtilen zamanda, hücreleri 10 dakika boyunca 500 x g’de santrifüj yapın. Lizisten önce, hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu atın. Ticari olarak temin edilebilen RNA izolasyon kitinden gelen talimatlarla yönlendirildiği gibi hücreleri derhal lize edin (bakınız Malzeme Tablosu). RNA izolasyonu ile devam edin veya daha sonra ek örneklerle işlemek için lizatı -80 ° C’de dondurun.NOT: RNA saflığı ve bütünlüğü mikrokapiller elektroforez kullanılarak doğrulanabilir. İsteğe bağlı: Saflaştırılmış RNA örneğinden tüm DNA izlerini tamamen çıkarmak için, üreticinin talimatlarına göre RNA temizleme kiti kullanın (bkz.

Representative Results

Bu protokol, PBMC’lerin SS kanından izolasyonu, CD4 + CD45RO + T hücrelerinin negatif seleksiyonla saflaştırılması, saflaştırılmış T hücrelerinin uyarılması ve transkriptomik profilleme için toplam RNA’nın izolasyonu için prosedürleri içerir. Şekil 1, PBMC’nin tam kandan izolasyon sürecini açıklamaktadır. SS PBMC’lerin toplam veriminin, her hastanın başlangıç kan hacmine ve dolaşımdaki tümör yüküne göre değişeceğini lütfen unutmayın. Laboratuvarımızda SS PBMC’lerin ortalama verimi 4.6 × 10 6 hücre/mL tam kan idi (1.85 × 7 SS için 106 – 3.25 x 107 hücre/mL). İzole PBMC’lerin ortalama yaşayabilirliği \u201299 idi. Şekil 2, seçilen CD4 + CD45RO + bellek T hücrelerinin yüksek saflığını ve canlılığını göstermektedir. SS PBMC’lerden CD4+CD45RO+ T hücrelerinin ortalama verimi (.6 – ) iken, lökoredüksiyon sistemi (LRS) odacıklarından elde edilen normal donör (ND) PBMC’lerden .9 (%3 – ) idi. Bu negatif seleksiyon protokolü ile elde edilen CD4+CD45RO+T hücrelerinin canlılığı ve saflığı sürekli olarak yüksek olmuştur (Şekil 3). Daha önce hem SS hem de ND T hücrelerinin transkriptomlarındaki fonksiyonel değişiklikleri incelemek için yukarıdaki aktivasyon protokolünü mikrodizilerle birleştirdik ve SS bellek T hücrelerinin ve SS PBMC’lerin ND T hücrelerine ve PBMC’lere kıyasla sitokin ve diğer bağışıklık tepkisi genlerini zayıf bir şekilde eksprese ettiğini gösterdik 19,22,23. Şekil 4, ND T hücrelerinde IL4, IL 10, IL13 ve IL22 dahil olmak üzere çeşitli sitokin genlerinin sağlam aktivasyonunu gösterir, ancak SS T hücrelerinde değildir. SS T hücrelerinde fonksiyonel gen ekspresyonundaki bu kusur o zamandan beri diğer gruplar24 tarafından doğrulanmıştır. Ek olarak, normalde ND T hücrelerinde eksprese edilmeyen birçok gen, hem istirahatte hem de stimülasyondan sonra SS T hücrelerinde yüksek oranda eksprese edilir (Şekil 4). Bunlar arasında daha önce tarif edilen SS biyobelirteç genleri DNM3, PLS3, TOX ve TWIST125,26,27’nin yanı sıra grubumuz tarafından ilk kez bildirilen ANK1 ve SGCE bulunmaktadır. Bu pozitif biyobelirteçler SS’de yüksek oranda eksprese edilir, ancak ND’de ifade edilmez ve negatif biyobelirteçlerle ilişkili teknik tuzaklardan kaçınır. Şekil 1: Tam kandan PBMC izolasyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: İzole PBMC’lerden CD4+ bellek T hücrelerinin negatif seçimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: CD4+CD45RO+T hücrelerinin saflığı akım sitometrisi ile doğrulandı. Lenfositler ışık saçılımı (A) ile kaplıydı, canlı lenfositler eFluor780 canlılık boyasını (B) dışladı ve (C) seçilmemiş normal donörleri (ND) temsil etti. Negatif seçilim, ND (D) ve SS hastalarında (E) CD45RO + T hücrelerinin neredeyse saf popülasyonlarıyla sonuçlandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: SS ve ND’den CD4 + CD45RO + bellek T hücrelerinin istirahatinde ve aktive edilmesinde diferansiyel gen ekspresyonu. Gen ekspresyonu z-skoru, kırmızıdan (yüksek ifade) yeşile (düşük ifade) kadar bir renk skalası ile temsil edilir. Isı haritasının üst kısmındaki renkli çubuklar hücre tedavilerini temsil eder: alay / araç muamelesi görmüş (kırmızı), 2 saat uyarılmış (mavi) ve 6 saat uyarılmış (sarı). Birkaç SS biyobelirteç geni yüksek oranda eksprese edilir ve sitokin genleri SS T hücrelerinde ND T hücrelerine kıyasla zayıf bir şekilde eksprese edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Reaktif Yoğunluk Ortamı Lenfosit Ayırma Ortamı, Fikoll-Hipak veya yoğunluğu olan eşdeğer yoğunluklu ortam = 20oC’de 1.077-1.080g / ml. HBSS 1x Hank’in dengeli tuz çözeltisi, 4,2 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7,2 RP10F Serisi RPMI 1640 orta, % 10 ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS), 1x penisilin-streptomisin çözeltisi, pH 7.2 ACK lizis tamponu 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH değerini ayarlamaya gerek yok. ~ 7.3 olmalıdır. Seçim tamponu 1x HBSS, %2 FBS, 2 mM EDTA phorbol12-myristate13-asetat (PMA) DMSO’da 50 μg/ml A23187 iyonofor DMSO’da 500 μg/ml Tablo 1: Reaktifler.

Discussion

PBMC’leri izole etmenin çeşitli yolları geliştirilmiştir ve her birinin kendi avantajları ve sınırlamaları vardır²⁸. Antikoagülan içeren beş adet 10 mL’lik tüpte rutin olarak 50 mL’ye kadar kan topluyoruz. PBMC izolasyonu için kanın hacmi, araştırma konusunun sağlığı ve yaşı gibi çeşitli faktörlere ve ayrıca flebotomist uzmanlığa bağlıdır. Protokoldeki kritik bir prosedürel adım, adım gradyanının oluşturulmasıdır. Kötü katmanlama, PBMC’lerin arabirimdeki tortuya kısmen veya tamamen başarısız olmasına neden olabilir. Alt katmanı başlatmak kolay olduğu için burada açıklanan alt katmanlama yöntemini tercih ediyoruz. Kanın altındaki tüm yoğunluk ortamını tamamen dağıtmak için, hava sızıntısı olmayan bir pipet yardımcısı kullanmak çok önemlidir. PBMC fraksiyonunun istenmeyen hücre tipleri tarafından kontaminasyonu, her izolasyon için aynı şekilde yapılması gereken buffy katın dikkatli ve tutarlı bir şekilde toplanmasıyla en aza indirilebilir. PBMC’ler daha fazla fraksiyone edilmeyecekse, izolasyonlar arasında yoğunluk gradyanı ve plazma katmanlarının farklı miktarlarının toplanmasından kaçınılmalıdır. RBC lizisi, kirletici RBC ve retikülosit türevi RNA’nın aşağı akış gen ekspresyon analizleri üzerindeki potansiyel etkisini en aza indirmek için gerçekleştirilir. Hipotonik lizis, aşırı izotonik tampon tarafından inhibe edilecektir.

T hücre alt kümesinin daha fazla izolasyonu moleküler çalışmalar için önemlidir. Burada, istenmeyen hücre tiplerini çıkarmak için negatif seçimle sonraki CD4 + CD45RO + T hücre seçimini tanımladık. Negatif seçilim, istenmeyen tüm hücreler için spesifik hücre yüzey belirteçlerini tanıyan antikorlara dayanır. Antikor kaplı hücreler daha sonra manyetik boncuklarla uzaklaştırılır. Bu seçim protokolü, el değmemiş ve uyarılmamış hedef hücrelerin serbest yüzer kalmasına izin verirken istenmeyen hücreleri ortadan kaldırır, bu da gen aktivasyonunu incelemek için gereklidir. Bununla birlikte, seçilen CD4 + CD45RO + T hücrelerinin son saflığını azaltan hücre kümelerinden kaçınmak için özen gösterilmelidir. Seçim tamponunda bulunan etilendiamintetraasetik asit (EDTA) hücre kümelenmesini en aza indirir. T hücrelerinin verimi, kanın başlangıç hacmi, hastaya uygulanan tedavi gibi hasta değişkenleri ve numune toplama sırasındaki hastalık evresi gibi faktörlere bağlıdır. Hastalara verilen tedavi hücre canlılığını da etkileyebilir. Ek olarak, fotoferez gibi herhangi bir işlemden önce numune toplanması da CD4 + CD45RO + T hücrelerinin saflığı üzerinde olumlu etkiye sahiptir. Fotoferez tedavisi sonrası örnek toplanmasının CD4+CD45RO+T hücre verimini olumsuz etkilediğini gözlemledik.

SS hastalarından alınan neoplastik T hücre klonları en sık olgun, bellek CD4 T hücre fenotipi^29,30 ile tutarlı yüzey belirteçleri eksprese ^eder. Bununla birlikte, CD4, CD45RO, CD45RA, CD7 ve / veya CD26³¹ gibi yüzey belirteçlerine göre zaman zaman fenotipik plastisite gözlenmiştir. Önceki çalışmalar ayrıca SS hastaları²⁹ arasında CD45RO ve CD45RA ekspresyonundaki heterojenliği gösterirken, SS vakalarının çoğunluğu hala CD45RO + ‘dır. Roelens ve ^ark.31 ayrıca SS’nin karışık naif (TN), merkezi bellek (TCM), geçiş belleği (TTM), efektör bellek (TEM) ve terminal efektör bellek (TEMRA) alt kümelerinin karışık popülasyonu ile bireyler arası ve bireyler arası heterojenlik sergileyebileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, sonuçları SS hücrelerinin çoğunun TCM fenotipine sahip olduğunu açıkça göstermektedir. Çalışmamızı SS hastalarında en sık görülen CD45RO+ yüzey immünofenotipine odakladık ve akım sitometrisi ile fenotipi doğruladık. Hastalarda T hücre alt gruplarının planlanmasında, çalışılan hastalığın fenotipik heterojenliğinin göz önünde bulundurulması önemlidir ve bu nedenle saflaştırma stratejisi, analiz için istenen T hücresi popülasyonunu elde etmek için gerektiği gibi ayarlanabilir.

Fonksiyonel gen ekspresyonunu incelemek için T hücrelerini ve PBMC’leri uyarmanın birkaç yolu vardır. Çekirdekteki gen regülasyonu ile ilgilendiğimiz için kimyasal aktivasyonu (PMA + A23187 iyonofor) tercih ediyoruz. Kimyasal aktivasyon bu amaç için en iyi seçenektir, çünkü geniş bir aktivatör görevi görür ve antijene özgü stimülasyona kıyasla daha homojendir. PMA, hücre zarından sitoplazmaya yayılan ve doğrudan protein kinaz C. A23187’yi aktive eden küçük bir organik bileşiktir. Bu bileşikler yüzey reseptörlerini atlar ve birlikte CD28’in aracılık ettiği ko-stimülasyon ile T hücresi reseptör ligasyonunun etkilerini taklit eder. Kimyasallar çeşitli hücre içi sinyal yollarını aktive eder, bu da nükleer transkripsiyon faktörü aktivasyonu ve transkripsiyon aktivasyonuna erişilebilen sitokin genlerinin upregülasyonuna neden olur. Kimyasal aktivasyon ve CD3CD28 ligasyonu normal hücrelerde çarpıcı derecede benzer küresel gen ekspresyon profilleri üretse de³², PMA + A23187 ile kimyasal aktivasyon iyi bir seçimdir, çünkü SS T hücreleri TCR bileşenleri³³ dahil yüzey reseptörlerinin ekspresyonunu kaybedebilir. Chong ve ^ark.22, normal, erken MF / CTCL ve geç MF / CTCL hastalarından PBMC’lerde PMA / A23187 ile anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları arasındaki sitokin genlerinin aktivasyonunu karşılaştırmıştır. PMA / A23187’nin, anti-CD3 / CD28 stimülasyonuna kıyasla IL-2 geninin daha hızlı ve yoğun aktivasyonuna neden olduğunu bildirmişlerdir. Ek olarak, anti-CD3 / CD28 antikorlarına sahip daha yavaş aktivasyon kinetiğinin, potansiyel olarak stimülasyon için gerekli olan çapraz bağlama ve membran sinyallemesinden kaynaklandığını gösterdiler. Ayrıca, incelenen farklı hücre popülasyonları arasında sitokinlerin ekspresyonundaki eğilimler PMA / A23187 ile korunmuştur. Gen ekspresyon aktivasyonu ile ilgilendiğimizden, kimyasal stimülasyon ideal bir yaklaşımdır çünkü geniş bir aktivatör görevi görür ve antijen spesifik stimülasyona kıyasla daha tutarlıdır. CD3/CD28 ligasyonu, membran bazlı sinyal iletiminde önemli olan yolları araştırmak için idealdir. Ek olarak, kimyasal aktivasyon daha ucuzdur ve özel ekipman gerektirmez. Bu çalışmada, PMA + A23187, ND hücrelerinde sitokin genlerini önemli ölçüde aktive etti, ancak SS T hücrelerinde değil, SS T hücrelerinin TCR’nin aşağı yönünde fonksiyonel eksiklikleri olduğunu düşündürdü.

Özetle, bu protokol değerli hasta kaynaklı kandan fenotipik saf T hücreleri ve fonksiyonel gen ekspresyonundaki genom çapındaki değişiklikleri değerlendirmek için bir yöntem sağlar. SS T hücrelerinin normal CD45RO + T hücrelerine kıyasla transkriptomik profillenmesinin, CTCL’li hastalardan taze insan T hücrelerinde gen aktivasyonunda derin farklılıklar ortaya koyduğunu gösterdik. Bu çalışmalar, KTHL’de yeni belirteçleri hedef alan tanısal biyobelirteçlerin ve terapötik stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Ek olarak, birincil insan T hücrelerini incelemedeki bu strateji ve protokol, diğer T hücresi aracılı hastalıkların çalışmalarına uyum sağlamada değerli olabilir.

Materials

1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	02-681-320
10 ml Disposable Plastic Pipette	Thermo Scientific	170356
1000 ul Pipet tips	VWR	10017-038
15 ml Conical Tubes	Corning	352196
25 ml Disposable Plastic Pipette	Thermo Scientific	170357
5 ml Disposable Plastic Pipette	Thermo Scientific	170355
50 ml Conical Tubes	Thermo Scientific	339652
A23187 ionophore	Fisher Scientific	BP595
Centrifuge	Thermo Scientific	75004381
DMSO	Sigma	D2650-5x5ml
EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit	StemCell	19157
FBS	GIBCO	16140-071
HBSS	GIBCO	14185-052
HEPES	Fisher Bioreagents	BP310-500
KHCO3	Fisher Bioreagents	P184-500
Lymphocyte Separation Medium	Corning	25-072-CV
Na2EDTA	ACROS	10378-23-1
NaHCO3	Fisher Bioreagents	S233-500
NH4Cl	Fisher Bioreagents	A661-500
Penicillin-streptomycin solution	GIBCO	15140122
phorbol12-myristate13-acetate (PMA)	Sigma	P-8139
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	RAININ	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+	RAININ	17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	RAININ	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	RAININ	17014392
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1013
Rneasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136
RPMI 1640	GIBCO	31800-022
T-25 Flask	Thermo Scientific	2024-10