חשיפת תפקידם של אזורים נפרדים במוח העכברוש בוויסות הביוץ באמצעות אי-פעילות הפיכה על ידי מיקרו-גניזמים של טטרודוטוקסין
Summary
פרוטוקול זה מתאר את בנייתה של מערכת מיקרו-הפעלה בעלות נמוכה, את ההשתלה הסטריאוטקסית שלה לתוך מבנים עמוקים במוח ואת ההליך למיקרו-נג’קציה מתוזמנות של טטרודוטוקסין בחולדות ערות וחסרות מעצורים. המטרה היא לחשוף את ההשתתפות של מבנים היפותלמיים ברגולציה של הביוץ על ידי עיכוב הפעילות העצבית שלהם.
Abstract
גישות ניסיוניות רבות שימשו לחקר תפקיד המוח בוויסות הביוץ. דוגמאות כוללות את הנגע ואת חירשות של קבוצות עצביות, שהן שתי שיטות פולשניות שפוגעות לצמיתות בשלמות אזור היעד. שיטות אלה מלוות בהשפעות בטחונות שיכולות להשפיע על ניתוח מנגנוני רגולציה חריפים וטמפורליים. ההשתלה הסטריאוטקסית של קנולות מדריך המכוונות לאזורי מוח ספציפיים, ואחריה תקופת התאוששות, מאפשרת לחוקרים למיקרו-זרם תרופות שונות לאחר היעלמות ההשפעות הבלתי רצויות של הניתוח. Tetrodotoxin שימש כדי לקבוע את התפקידים של מספר אזורי מוח בתהליכים פיזיולוגיים מגוונים כי זה מעכב באופן חולף את פוטנציאל הפעולה תלוי נתרן, ובכך חוסם את כל הפעילות העצבית באזור היעד. פרוטוקול זה משלב שיטה זו עם אסטרטגיות להערכת מחזור estrous וביוץ כדי לחשוף את התפקיד של אזורי מוח נפרדים בוויסות הביוץ בזמנים מסוימים של כל שלב נתון של מחזור אסטרוס. חולדות ערות וחסרות מעצורים (Rattus norvegicus) שימשו כדי למנוע את השפעות החסימה כי הרדמה והורמוני מתח להפעיל על הביוץ. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות למינים אחרים, מטרות המוח וסוכנים פרמקולוגיים ללמוד תהליכים פיזיולוגיים שונים. שיפורים עתידיים בשיטה זו כוללים את העיצוב של מערכת microinjection באמצעות נימים זכוכית בקוטר קטן במקום קנולות מדריך. זה יפחית את כמות הרקמה שניזוקה במהלך ההשתלה ויפחית את התפשטות התרופות המושרות מחוץ לאזור היעד.
Introduction
הביוץ הוא התהליך שבו ביציות בוגרות אחת או יותר משתחררות מהשחלות אחת ל-estral/מחזור החודשי. מכיוון שכל מיני היונקים תלויים בייצור הגמטים להתרבות, להבנת המנגנונים המסדירים את הביוץ יש השפעה עצומה בתחומים החל מביו-רפואה, תעשיית בעלי החיים ותחזוקת מינים בסכנת הכחדה. הביוץ מוסדר על ידי ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-השחלות, אשר כרוך במספר אזורים היפותלמיים ואקסטרה-ההיפותלמיים, הגונדוטרופים בבלוטת יותרת המוח העורפית והתקה ותאי הגרנולוזה, יחד עם הביצים, יוצרים את זקיקי השחלות בתוך השחלות1.
זקיקי השחלות לגדול, לפתח ובסופו של דבר לביוץ בתגובה הפרשת טוניק פאזי של ההורמון מגרה זקיק ואת ההורמון נוהם, שני גונדוטרופינים מופרש על ידי gonadotropes. התבנית של הפרשת גונדוטרופין היא מרכזית להתפתחות זקיקית נכונה וביוץ והוא מוסדר על ידי הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH)1,2. נוירופפטיד זה מסונתז על ידי נוירונים הפזורים ברחבי הדיאנספלון הבזלי ולאחר מכן מופרש לערם השער המקשר את ההיפותלמוס ואת בלוטת יותרת המוח הצפונית. הפעילות הפרשתית של נוירוני GnRH מווסת על ידי קלט סינפטי הנובע ממבנים מוחיים מגוונים. מבנים אלה מעבירים מידע על מצב הסביבה החיצונית והפנימית של האורגניזם כולל זמינות המזון, אורך הפוטופריודה וריכוז ההורמונים בדם. במובן זה, הם מעצבים את דפוס הרבייה של כל מין ואת התפקידים הספציפיים של מבנים כאלה חייב להיקבע על מנת להבין כראוי את המנגנונים השולטים בביוץ. כדוגמה, הוכח כי התנודתיות ברמות אסטרדיול במהלך מחזור אסטרוס מסדירה את הפרשת GnRH; עם זאת, GnRH-נוירונים אינו מבטא את isoform קולטן אסטרדיול הדרוש כדי לזהות שינויים כאלה. שתי אוכלוסיות של נוירונים המבטאים קולטנים אלה ממוקמים באזור periventricular rostral של החדר השלישי ובגרעין arcuate, בהתאמה, וסינפסות ייצוב עם נוירונים GnRH. יש ראיות להציע כי נוירונים אלה לפרש את הריכוז של אסטרדיול ולאחר מכן לעורר את הפעילות של GnRH-נוירונים על ידי שחרור kisspeptin, משרן חזק של הפרשת GnRH3.
ניסויים הכוללים נגעים תרמיים או כימיים, כמו גם חירשות מכנית, אפשרו לחוקרים לקבוע את מעורבותם של מספר מבני מוח בוויסות הביוץ4,5,6,7,8,9,10,11,12 . ניסויים אלה, עם זאת, יש את החיסרון של להיות פולשני וטראומטי, הדורש כמה ימים של התאוששות לפני הערכת ההשפעות של הטיפול, לעכב את הניתוח של ההשפעות החריפות של הטיפול. בנוסף, הם משפיעים לצמיתות על האזורים הממוקדים ומשבשים תהליכים פיזיולוגיים אחרים בטווח הארוך. בשל בעיות אלה, התוצאות של ניסויים אלה מוסתרות בדרך כלל על ידי מנגנוני פיצוי הומיאוסטטיים בגוף החיה וחילוץ מידע מדויק על הדינמיקה הרגולטורית הזמנית שבה האזור מעורב הוא די קשה.
המיקרו-נסיגה של תרופות שמשבשות באופן חולף את פעילותם של נוירונים באמצעות קנולס מדריך היא חלופה מתאימה העולה על החסרונות שהוזכרו לעיל. הקנולות יכולות להיות ממוקמות בכל אזור במוח על ידי ניתוח סטריאוטקסי, המאפשר לחוקר להתחיל את הטיפול התרופתי לאחר שההשפעות המבלבלות של הניתוח נעלמות. המיקרו-הזדקנות המתוזמנות של התרופות מאפשרת לחוקרים לבחון השערות לגבי תרומת האזור לשלב מסוים של התהליך וניתן לבצען בבעלי חיים ערים מרוסנים או חופשיים. מגוון רחב של תרופות כולל הרדמה מקומית, אגוניסטים, אנטגוניסטים, אגוניסטים הפוכים ורעלים ביולוגיים כגון tetrodotoxin (TTX) ניתן microinjected לתוך אזור עניין בזמנים ספציפיים.
TTX הוא רעלן ביולוגי מסונתז על ידי חיידקים החיים בגוף של דגי הנפוחיות, כמו גם בעלי חוליות אחרים חסרי חוליות. TTX משתיק פעילות עצבית באמצעות המצור הסלקטיבי והחולף של ערוצי נתרן, אשר גורם לעיכוב של פוטנציאל פעולה תלוי נתרן. בנוכחות TTX, תאים חווים שינוי בשלב ההפחתה ולכן אינם נרגשים אך נשארים בחיים. אפקט החסימה של TTX מוסבר על ידי ההרכב המולקולרי שלה: קבוצת guanidinium הוא מסוגל לעבור דרך ההיבט החוץ תאי של ערוץ נתרן, אבל שאר המולקולה לא יכול לעבור בשל גודלו, ולכן הוא תקוע וחוסם את ערוץ13,14,15,16,17 . מנגנון הפעולה של TTX אפשר את השימוש בו ככלי ללמוד את מערכת העצבים הן במבחנה והן ב- vivo. הזרקה תוך מוחית של רעלן זה שימשה כדי לחקור את התפקיד של אזורי מוח נפרדים במספר תהליכים כמו שימור זיכרון18, שינה וגירוי19, זיהוי מקום20, ניווט מרחבי21, שימוש בסמים22, thermoregulation23, התפתחות של סכיזופרניה24, התנהגות מינית25 ורגולציה של הביוץ26 בין היתר. בפרוטוקול זה אנו מתארים את ההשפעות על הביוץ של חוסר הפעילות החולפת של גרעינים היפותלמיים על ידי מיקרו-בייג’ן TTX בחולדות ערות וחסרות מעצורים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר שיטה לנטרל באופן חולף, בכל זמן נתון, אזור נפרד במוחם של חולדות ערות וחסרות מעצורים. שיטה פשוטה כדי לעקוב אחר מחזור estrous שלהם ולהעריך ביוץ מסופק גם. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח פשוט של תרומתם של אזורי מוח ספציפיים למנגנונים המניעים ביוץ על ידי השוואת התוצאה הביוץ של בעלי חיים שטופלו …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לריימונד סנצ’ז מאוניברסיטת וושינגטון על עזרתו היקרה בעריכת כתבי יד M.Sc ג’ורג’ינה קורטס M.Sc סינציה חוויאר על תמיכתם הטכנית בתקינה של טכניקה זו. אנו מודים גם לחברי שירותי הווטרינר בפקולטה דה אסטודיוס סופריור סרגוסה: MVZ. אדריאנה אלטאמירנו, MVZ. רומן הרננדז ו-MVZ. דולורס-אליזבת גוזמן לתחזוקה וטיפול מצוין בבעלי חיים ניסיוניים. הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה נתמכו על ידי מספר מענק DGAPA-PAPIIT: IN216015 ועל ידי מספר מענק CONACyT: 236908 לרוברטו דומינז. קרלוס-קמילו סילבה הוא דוקטורנט מתוכנית דה דוקטורדו en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) ונתמך על ידי הקונז’ו הלאומי דה סינסיה y Tecnología (מספר גרנט: 294555).
Materials
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
References
- Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
- Fink, G., Conn, M., Freeman, E. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. , 107-133 (2000).
- Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
- Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
- Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
- Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
- Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
- Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
- Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
- Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
- Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
- Halász, B., Köves, K., Molnár, J. Neural control of ovulation. Human Reproduction. 3 (1), 33-37 (1988).
- Narahashi, T. Pharmacology of tetrodotoxin. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 20 (1), 67-84 (2001).
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
- Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
- Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
- Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
- Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
- Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749 (2013).
- Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
- Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
- Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
- Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
- Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , (2014).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538 (2012).
- Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
- Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
- Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
- Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
- James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
- Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
- Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
- Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082 (2010).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Cunningham, M. G., O’Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716 (2008).
- Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
