Tetrodotoksin Mikroenjeksiyonları ile Ters İnaktivasyon Yoluyla Yumurtlamanın Düzenlenmesinde Sıçan Beyninin Ayrık Alanlarının Rolünün Çözülmesi
Summary
Bu protokol, düşük maliyetli bir mikroenjeksiyon sisteminin inşasını, derin beyin yapılarına stereotaksik implantasyonunu ve uyanık ve sınırsız sıçanlarda tetrodotoksin zamanlanmış mikroenjeksiyon prosedürünü açıklar. Amaç, hipotalamik yapıların nöral aktivitelerini engelleyerek yumurtlamanın düzenlenmesine katılımını ortaya çıkarmaktır.
Abstract
Yumurtlamanın düzenlenmesinde beynin rolünü incelemek için birçok deneysel yaklaşım kullanılmıştır. Örnekler arasında, her ikisi de hedef alanın bütünlüğünü kalıcı olarak bozan invaziv yöntemler olan nöronal grupların lezyonu ve sağırferentasyonu say verilebilir. Bu yöntemlere akut ve zamansal düzenleyici mekanizmaların analizini etkileyebilecek ikincil etkiler eşlik eder. Belirli beyin bölgelerini hedefleyen kılavuz kanüllerin stereotaksik implantasyonu, ardından bir iyileşme dönemi, araştırmacıların ameliyatın istenmeyen etkilerinin ortadan kalkmasından sonra farklı ilaçları mikroenject etmelerini sağlar. Tetrodotoksin, çeşitli fizyolojik süreçlerde birkaç beyin bölgesinin rollerini belirlemek için kullanılmıştır, çünkü sodyuma bağımlı eylem potansiyellerini geçici olarak inhibe eder, böylece hedef bölgedeki tüm sinirsel aktiviteyi engeller. Bu protokol, bu yöntemi, östrous döngüsünün herhangi bir aşamasının belirli zamanlarında yumurtlamanın düzenlenmesinde ayrı beyin bölgelerinin rolünü ortaya çıkarmak için östrous döngüsünün ve yumurtlamanın değerlendirilmesi için stratejilerle birleştirir. Anesteziklerin ve stres hormonlarının yumurtlama üzerinde uyguladığı bloke etme etkilerinden kaçınmak için uyanık ve sınırsız sıçanlar(Rattus norvegicus)kullanılmıştır. Bu protokol, farklı fizyolojik süreçleri incelemek için diğer türlere, beyin hedeflerine ve farmakolojik ajanlara kolayca uyarlanabilir. Bu yöntemde gelecekteki iyileştirmeler, kılavuzüller yerine küçük çaplı cam kılcal damarlar kullanılarak bir mikroenjeksiyon sisteminin tasarlanmasını içerir. Bu, implantasyon sırasında hasar gören doku miktarını azaltacak ve aşılanan ilaçların hedef alan dışına yayılmasını azaltacaktır.
Introduction
Yumurtlama, her estral/adet döngüsünde bir veya daha fazla olgun oositin yumurtalıklardan salındığı süreçtir. Tüm memeli türleri üremek için gametlerin üretimine bağlı olduğu için, yumurtlamayı düzenleyen mekanizmaların anlaşılması biyotıp, hayvancılık endüstrisi ve nesli tükenmekte olan türlerin bakımından geniş alanlarda büyük bir etkiye sahiptir. Yumurtlama, birkaç hipotalamik ve ekstra hipotalamik alanı, ön hipofizdeki gonadotropları ve oositlerle birlikte yumurtalıkların içindeki yumurtalık köklerini oluşturan theca ve granüloza hücrelerini içeren hipotalamik-hipofiz-yumurtalık ekseni ile düzenlenir1.
Yumurtalık folikülleri, folikül uyarıcı hormonun tonik ve phasic salgılanmasına ve gonadotroplar tarafından salgılanan iki gonadotropin olan luteinize edici hormona yanıt olarak büyür, gelişir ve sonunda yumurtlar. Gonadotropin salgılama patörü, uygun foliküler gelişim ve yumurtlama için çok önemlidir ve gonadotropin salgılayan hormon (GnRH)1,2tarafından düzenlenir. Bu nöropeptid, bazal diencephalon boyunca dağılmış nöronlar tarafından sentezlendi ve daha sonra hipotalamus ve ön hipofizini birbirine bağlayan portal vaskülat salgılandı. GnRH-nöronların salgı aktivitesi, çeşitli beyin yapılarından kaynaklanan sinaptik girdi ile modüle edilir. Bu yapılar, yiyeceklerin mevcudiyeti, fotoperiyodun uzunluğu ve kandaki hormonların konsantrasyonu da dahil olmak üzere organizmanın dış ve iç ortamının durumu hakkında bilgi aktarır. Bu anlamda, her türün üreme düzenini şekillendiriyorlar ve yumurtlamayı yöneten mekanizmaların düzgün bir şekilde anlaşılması için bu tür yapıların belirli rolleri belirlenmelidir. Örnek olarak, östrous döngüsü sırasında estradiol seviyelerindeki dalgalanmanın GnRH salgısını düzenlediği gösterilmiştir; bununla birlikte, GnRH-nöronları bu tür değişiklikleri tespit etmek için gereken estradiol reseptör izoformını ifade etmez. Bu reseptörleri ifade eden iki nöron popülasyonu, sırasıyla üçüncü ventrikülün rostral periventriküler bölgesinde ve arcuate çekirdeğinde ve GnRH-nöronları ile stablish sinapslarında bulunur. Bu nöronların estradiol konsantrasyonunu yorumladığını ve daha sonra GnRH salgısının güçlü bir indüktörü olan kisspeptin’i serbest bırakarak GnRH-nöronlarının aktivitesini uyardığını gösteren kanıtlarvardır 3.
Thermik veya kimyasal lezyonların yanı sıra mekanik sağırferentasyonu içeren deneyler, araştırmacıların yumurtlama4,5 , 6 , 7 ,8,9,10,11,12’nin düzenlenmesinde birkaç beyin yapılarının katılımını belirlemelerine izinverdi. . Bununla birlikte, bu deneyler invaziv ve travmatik olmanın dezavantajıdır, tedavinin etkilerini değerlendirmeden önce birkaç gün iyileşme gerektirir ve tedavinin akut etkilerinin analizini engeller. Ayrıca hedeflenen alanları kalıcı olarak etkiler ve uzun vadede diğer fizyolojik süreçleri bozar. Bu sorunlar nedeniyle, bu deneylerin sonuçları genellikle hayvanın vücudundaki homeostatik telafi edici mekanizmalar tarafından gizlenmektedir ve alanın dahil olduğu zamansal düzenleyici dinamikler hakkında doğru bilgi almak oldukça zordur.
Nöronların aktivitesini geçici olarak bozan ilaçların kılavuz kanüller aracılığıyla mikroenjeksiyonu, yukarıda belirtilen dezavantajları aşan uygun bir alternatiftir. Kanüller stereotaksik bir ameliyatla herhangi bir beyin bölgesine yerleştirilecek ve araştırmacının ameliyatın şaşırtıcı etkileri ortadan kaybolduktan sonra ilaç tedavisine başlamasını sağlar. İlaçların zamanlanmış mikroenjeksiyon, araştırmacıların bölgenin sürecin belirli bir adımına katkısı ile ilgili hipotezleri test etmelerini sağlar ve uyanık kısıtlanmış veya serbest hareket eden hayvanlarda gerçekleştirilebilir. Lokal anestezistler, agonistler, antagonistler, ters agonistler ve tetrodotoxin (TTX) gibi biyolojik toksinler de dahil olmak üzere çeşitli ilaçlar belirli zamanlarda ilgi alanına mikroenjeksiyon yapılabilir.
TTX, kirpi balığının vücudunda yaşayan bakterilerin yanı sıra diğer omurgalılar ve omurgasızlar tarafından sentezlenen biyolojik bir toksindir. TTX, sodyum kanallarının seçici ve geçici ablukası yoluyla sinirsel aktiviteyi susturur, bu da sodyuma bağımlı eylem potansiyellerinin inhibisyonu ile sonuçlanır. TTX varlığında, hücreler depolarizasyon aşamasında bir değişiklik yaşarlar ve bu nedenle heyecan verici değildir, ancak canlı kalırlar. TTX’in bloke etkisi moleküler bileşimi ile açıklanmaktadır: bir guanidinium grubu sodyum kanalının hücre dışı yönünden geçebilir, ancak molekülün geri kalanı boyutu nedeniyle geçemez, bu nedenle sıkışmıştır ve kanal13 , 14,15,16,17’yi engeller. . TTX’in etki mekanizması, sinir sistemini hem in vitro hem de in vivo incelemek için bir araç olarak kullanılmasına izin verdi. Bu toksinin intraserebral enjeksiyonu, hafıza tutma18,uyku ve uyarılma 19 , yer tanıma20, mekansal navigasyon21, uyuşturucu bağımlılığı 22 , termoregülasyon23, şizofreni gelişimi24,cinsel davranış25ve yumurtlamanın düzenlenmesi26gibi çeşitli işlemlerde ayrı beyin bölgelerinin rolünü incelemek için kullanılmıştır. diğerleri arasında. Bu protokolde hipotalamik çekirdeklerin uyanık ve sınırsız sıçanlarda TTX mikroenjeksiyonu ile geçici inaktivasyonunun yumurtlaması üzerindeki etkileri açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, uyanık ve sınırsız sıçanların beyninde herhangi bir zamanda ayrı bir bölgeyi geçici olarak devre dışı bırakma yöntemi açıklanmaktadır. Östrous döngülerini izlemek ve yumurtlamayı değerlendirmek için basit bir yöntem de sağlanır. Bu protokol, TTX ile tedavi edilen hayvanların yumurtlama sonuçlarını araç tarafından tedavi edilenlerinkiyle karşılaştırarak belirli beyin bölgelerinin yumurtlamayı yönlendiren mekanizmalara katkısının basit bir analizine izin verir. Nörob…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Washington Üniversitesi’nden Raymond Sanchez’e el yazması düzenlemedeki değerli yardımları ve M.Sc Georgina Cortés ve M.Sc Cintia Javier’e bu tekniğin standartlaştırılmasındaki teknik destekleri için minnettarız. Ayrıca Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ’deki veterinerlik hizmetleri üyelerine de minnettarız. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández ve MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán deney hayvanlarının mükemmel bakımı ve bakımı için. Bu protokolde açıklanan deneyler DGAPA-PAPIIT hibe numarası: IN216015 ve CONACyT hibe numarası: roberto Domínguez’e 236908 desteklendi. Carlos-Camilo Silva, Program de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) doktor öğrencisidir ve Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Hibe numarası: 294555) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
References
- Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
- Fink, G., Conn, M., Freeman, E. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. , 107-133 (2000).
- Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
- Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
- Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
- Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
- Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
- Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
- Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
- Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
- Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
- Halász, B., Köves, K., Molnár, J. Neural control of ovulation. Human Reproduction. 3 (1), 33-37 (1988).
- Narahashi, T. Pharmacology of tetrodotoxin. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 20 (1), 67-84 (2001).
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
- Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
- Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
- Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
- Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
- Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749 (2013).
- Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
- Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
- Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
- Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
- Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , (2014).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538 (2012).
- Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
- Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
- Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
- Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
- James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
- Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
- Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
- Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082 (2010).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Cunningham, M. G., O’Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716 (2008).
- Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
