Démêler le rôle des zones discrètes du cerveau du rat dans la régulation de l’ovulation par inactivation réversible par des microinjections de tétrodotoxines
Summary
Ce protocole décrit la construction d’un système de micro-injection à faible coût, son implantation stéréotaxique dans les structures cérébrales profondes et la procédure de microinjections chronométrées de tétrodotoxine chez des rats éveillés et non effrénés. L’objectif est de révéler la participation des structures hypothalamiques à la régulation de l’ovulation en inhibant leur activité neuronale.
Abstract
De nombreuses approches expérimentales ont été utilisées pour étudier le rôle du cerveau dans la régulation de l’ovulation. Les exemples incluent la lésion et la désafférentation des groupes neuronaux, qui sont deux méthodes invasives qui nuisent de manière permanente à l’intégrité de la zone cible. Ces méthodes s’accompagnent d’effets collatéraux qui peuvent affecter l’analyse des mécanismes de régulation aiguë et temporelle. L’implantation stéréotaxique de canules guides visant des régions spécifiques du cerveau, suivie d’une période de récupération, permet aux chercheurs de micro-injecter différents médicaments après la disparition des effets indésirables de la chirurgie. La tétrodotoxine a été utilisée pour déterminer les rôles de plusieurs zones du cerveau dans divers processus physiologiques, car elle inhibe transitoirement les potentiels d’action dépendants du sodium, bloquant ainsi toute activité neuronale dans la région cible. Ce protocole combine cette méthode avec des stratégies d’évaluation du cycle œstré et de l’ovulation pour révéler le rôle des régions cérébrales discrètes dans la régulation de l’ovulation à des moments particuliers d’un stade donné du cycle œstré. Des rats éveillés et non effrénés (Rattus norvegicus) ont été utilisés pour éviter les effets bloquants que les anesthésiques et les hormones de stress exercent sur l’ovulation. Ce protocole peut être facilement adapté à d’autres espèces, cibles cérébrales et agents pharmacologiques pour étudier différents processus physiologiques. Les améliorations futures de cette méthode comprennent la conception d’un système de micro-injection utilisant des capillaires en verre de petit diamètre au lieu de canules de guidage. Cela réduira la quantité de tissu endommagé pendant l’implantation et diminuera la propagation des médicaments perfusés en dehors de la zone cible.
Introduction
L’ovulation est le processus par lequel un ou plusieurs ovocytes matures sont libérés des ovaires une fois par cycle estral / menstruel. Comme toutes les espèces de mammifères dépendent de la production de gamètes pour se reproduire, la compréhension des mécanismes qui régulent l’ovulation a un impact énorme dans des domaines allant de la biomédecine à l’industrie de l’élevage et au maintien des espèces menacées. L’ovulation est régulée par l’axe hypothalamo-hypophyso-ovarien, qui implique plusieurs zones hypothalamiques et extra-hypothalamiques, les gonadotropes de l’hypophyse antérieure et les cellules thèque et granulosa qui, avec les ovocytes, forment les follicules ovariens à l’intérieur des ovaires1.
Les follicules ovariens se développent, se développent et éventuellement ovulent en réponse à la sécrétion tonique et phasique de l’hormone folliculo-stimulante et de l’hormone lutéinisante, les deux gonadotrophines sécrétées par les gonadotrophes. Le schéma de sécrétion de gonadotrophine est essentiel pour le bon développement folliculaire et l’ovulation et il est régulé par l’hormone de libération des gonadotrophines (GnRH)1,2. Ce neuropeptide est synthétisé par des neurones dispersés dans tout le dencéphale basal puis sécrétés dans le système vasculaire portail qui relie l’hypothalamus et l’hypophyse antérieure. L’activité sécrétoire des neurones de la GnRH est à son tour modulée par l’entrée synaptique provenant de diverses structures cérébrales. Ces structures transmettent des informations sur l’état de l’environnement externe et interne de l’organisme, y compris la disponibilité de la nourriture, la durée de la photopériode et la concentration d’hormones dans le sang. En ce sens, ils façonnent le schéma de reproduction de chaque espèce et les rôles spécifiques de ces structures doivent être déterminés afin de bien comprendre les mécanismes régissant l’ovulation. À titre d’exemple, il a été démontré que la fluctuation des niveaux d’œstradiol au cours du cycle œstré régule la sécrétion de GnRH; cependant, les neurones de la GnRH n’expriment pas l’isoforme du récepteur de l’œstradiol nécessaire pour détecter de tels changements. Deux populations de neurones exprimant ces récepteurs sont situées dans la région périventriculaire rostrale du troisième ventricule et dans le noyau arquié, respectivement, et forment des synapses avec des neurones GnRH. Il existe des preuves suggérant que ces neurones interprètent la concentration d’œstradiol et stimulent ensuite l’activité des neurones de la GnRH en libérant de la kisspeptine, un puissant inducteur de la sécrétion de GnRH3.
Des expériences impliquant des lésions thermiques ou chimiques, ainsi qu’une désafférentation mécanique, ont permis aux chercheurs de déterminer l’implication de plusieurs structures cérébrales dans la régulation de l’ovulation4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Ces expériences ont cependant l’inconvénient d’être invasives et traumatisantes, nécessitant plusieurs jours de récupération avant d’évaluer les effets du traitement, ce qui entrave l’analyse des effets aigus du traitement. De plus, ils affectent en permanence les zones ciblées et perturbent d’autres processus physiologiques à long terme. En raison de ces problèmes, les résultats de ces expériences sont généralement obscurcis par les mécanismes compensatoires homéostatiques dans le corps de l’animal et il est plutôt difficile d’extraire des informations précises sur la dynamique de régulation temporelle dans laquelle la zone est impliquée.
La microinjection de médicaments qui perturbent transitoirement l’activité des neurones à travers des canules guides est une alternative appropriée qui surpasse les inconvénients mentionnés ci-dessus. Les canules peuvent être placées dans n’importe quelle région du cerveau par une chirurgie stéréotaxique, permettant au chercheur de commencer le traitement médicamenteux après la disparition des effets confondants de la chirurgie. La micro-injection chronométrée des médicaments permet aux chercheurs de tester des hypothèses concernant la contribution de la région à une étape particulière du processus et peut être effectuée chez des animaux éveillés retenus ou en mouvement libre. Une variété de médicaments, y compris les anesthésiques locaux, les agonistes, les antagonistes, les agonistes inverses et les toxines biologiques telles que la tétrodotoxine (TTX) peuvent être microinjectés dans la région d’intérêt à des moments spécifiques.
TTX est une toxine biologique synthétisée par des bactéries vivant dans le corps du poisson-globe ainsi que d’autres vertébrés et invertébrés. TTX réduit au silence l’activité neuronale par le blocage sélectif et transitoire des canaux sodiques, ce qui entraîne l’inhibition des potentiels d’action dépendants du sodium. En présence de TTX, les cellules subissent une altération de la phase de dépolarisation et ne sont donc pas excitables mais restent vivantes. L’effet bloquant du TTX s’explique par sa composition moléculaire: un groupe guanidinium est capable de passer à travers l’aspect extracellulaire du canal sodique, mais le reste de la molécule ne peut pas passer en raison de sa taille, il est donc coincé et bloque le canal13,14,15,16,17 . Le mécanisme d’action du TTX a permis son utilisation comme outil pour étudier le système nerveux à la fois in vitro et in vivo. L’injection intracérébrale de cette toxine a été utilisée pour étudier le rôle des zones cérébrales discrètes dans plusieurs processus tels que la rétention de la mémoire18, le sommeil et l’excitation19, la reconnaissance de lieu20, la navigation spatiale21, l’abus dedrogues 22, la thermorégulation23, le développement de la schizophrénie24, le comportement sexuel25 et la régulation de l’ovulation26 entre autres. Dans ce protocole, nous décrivons les effets sur l’ovulation de l’inactivation transitoire des noyaux hypothalamiques par microinjection TTX chez des rats éveillés et non drainés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit une méthode pour inactiver transitoirement, à un moment donné, une région discrète dans le cerveau de rats éveillés et non captés. Une méthode simple pour suivre leur cycle œstrous et évaluer l’ovulation est également fournie. Ce protocole permet une analyse simple de la contribution de régions cérébrales spécifiques aux mécanismes qui conduisent à l’ovulation en comparant le résultat ovulatoire des animaux traités par TTX avec celui des animaux traités par véhicule. À l’e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Raymond Sanchez de l’Université de Washington pour son aide précieuse dans l’édition de manuscrits et à M.Sc. Georgina Cortés et M.Sc. Cintia Javier pour leur soutien technique dans la normalisation de cette technique. Nous sommes également reconnaissants aux membres des services vétérinaires de Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández et MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán pour l’excellent entretien et les soins des animaux de laboratoire. Les expériences décrites dans ce protocole ont été soutenues par le numéro de subvention DGAPA-PAPIIT : IN216015 et par le numéro de subvention CONACyT : 236908 à Roberto Domínguez. Carlos-Camilo Silva est doctorant au Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) et est soutenu par le Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Numéro de subvention: 294555).
Materials
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
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