Forutsi amputasjon ved hjelp av lokale sirkulerende mononukleære stamceller hos angioplastiske pasienter med kritisk lem iskemi
Summary
Amputasjon av nedre ekstremiteter kan oppstå selv etter angioplastikk av hindret fartøy i Kritisk Lem Iskemi (CLI). Mononukleære stamceller (MPCer) reflekterer vaskulær reparasjon. Den nåværende protokollen beskriver kvantifiseringen av MPCer fra sirkulasjon nær angioplastikk, og dens forhold til endoteldysfunksjon og prediksjon av amputasjon av nedre ekstremiteter.
Abstract
Kritisk lem iskemi (CLI) representerer et avansert stadium av perifer arteriell sykdom. Angioplastikk forbedrer blodstrømmen til underbenet; Noen pasienter utvikler seg imidlertid irreversibelt til amputasjon av lemmer. Omfanget av vaskulær skade og mekanismene for vaskulær reparasjon er faktorer som påvirker utfallet etter angioplastikk. Mononukleære stamceller (MPCer) er reaktive for vaskulær skade og reparasjon, med evnen til å reflektere vaskulære sykdommer. Den nåværende protokollen beskriver kvantifisering av MPCer hentet fra blodsirkulasjon fra fartøyet nær angioplastikkstedet, samt forholdet til endoteldysfunksjon og dens prediktive evne til lemamputasjon i de neste 30 dagene etter angioplastikk hos pasienter med CLI.
Introduction
Perifer arteriell sykdom (PAD) er preget av en kronisk og progressiv vaskulær obstruksjon med begrensning av blodtilførsel1. I global skala påvirker PAD i underekstremitetene rundt 10% av den eldre befolkningen, mens opptil 7% av slike tilfeller sendes til lemamputasjon2,3.
Kritisk Limb Iskemi (CLI) representerer den mest alvorlige presentasjonen av PAD1. Pasienter opplever vanligvis smerte i ro, sår eller koldbrann som kan tilskrives okkluderte arterier; mens klinisk prognose er ugunstig og preget av en 30% risiko for lem amputasjon og dødelighet i løpet av 1 år3,4,5.
Angioplastikk er en minimal invasiv endovaskulær prosedyre som kan gjenopprette blodstrømmen til underbenet hos pasienter med CLI; Noen pasienter vil imidlertid uunngåelig kreve store lemamputasjon, selv etter angioplastisk terapi1,5. Tidlig identifisering av ugunstige resultater etter angioplastikk er ganske verdifull, på grunn av muligheten for behandlingshåndhevelse.
Tradisjonelle risikofaktorer kan gi en begrenset prediktiv evne til store lem amputasjon hos pasienter med CLI gjennomgår angioplastikk6. Patofysiologiorienterte biomarkører representerer nye metoder med potensielle kliniske anvendelser, noe som kan resultere spesielt nyttig i sykdommer relatert til vaskulær skade7. I dag har deltakelsen av cellulære populasjoner som eier endotelreparasjonsegenskaper, på stedet av aterosklerotisk plakett, blitt stadig meranerkjent 8,9.
Mononukleære stamceller (MPCer) er avledet fra benmargen og egne strukturelle og funksjonelle egenskaper ved stamceller med vaskulære regenerative evner. På grunn av MPC evne til å spre, migrere og vise vaskulær etterlevelse; disse cellene har blitt gode kandidater til å reflektere endotelreparasjon som svar påiskemi 10,11,12. I tillegg har kontinuerlig interesse for mekanismer underliggende vaskulær skade motivert til å utforske den prognostiske rollen til lokale forekommende biomarkører, siden de anses å reflektere vaskulær skade ogreparere 7,13,14.
Formålet med den nåværende studien er å beskrive hvordan man skal bestemme hvor mye MPCer som sirkulerer nær vaskulær obstruksjon hos pasienter med CLI som gjennomgår angioplastikk; og hvordan å evaluere forholdet mellom MPC med indikatorer på endoteldysfunksjon og lem amputasjon.
Sammenlignet med prognosen basert på komorbiditeter og iboende vaskulære egenskaper, viser mengden lokale MPCer spesifikk evne til å forutsi klinisk utfall angående endoteldysfunksjon og lemamputasjon. Konsekvent har noen studier beskrevet den prognostiske rollen til lignende biomarkører under evalueringen av pasienter med PAD15,16.
Basert på tidligere resultater7, kan metoden beskrevet her være nyttig for en tidlig identifisering av populasjon med risiko for uønskede vaskulære resultater i flere kliniske innstillinger, for eksempel nedre lem og koronar iskemi, hjerneslag, vaskulitt, venøs trombose og andre som involverer vaskulær skade og reparasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Blodinnsamling på det nøyaktige stedet av vaskulær blokk kan vise tekniske problemer; Derfor utførte vi blodsamling i nærheten av vaskulær blokk. På samme måte synes mengden mpc nær vaskulær plakk å være svært dynamisk og kan oppstå variasjoner før og etter angioplastikk. Ifølge våre observasjoner anbefales det å evaluere baseline- og 30min-post-angioplastikkendringer i antall MPCer, siden de kan gjenspeile flere patofysiologiske prosesser som forekommer innen vaskulær skade og reparasjon.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker støtten fra Institutional Program E015 for prosjekt-ID 356.2015.
Materials
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12×75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
References
- Serrano-Hernando, F. J., Martín-Conejero, A. Peripheral artery disease: Pathophysiology, diagnosis and treatment. Revista Española de Cardiología. 60 (9), 969-982 (2007).
- Agarwal, S., et al. Burden of re-admissions among patients with critical limb ischemia. Journal of the American College of Cardiology. 69 (15), 1897-1908 (2017).
- Kolte, D., et al. Thirty-day re-admissions after endovascular or surgical therapy for critical limb ischemia: Analysis of the 2013 to 2014 nationwide re-admissions databases. Circulation. 136 (2), 167-176 (2017).
- Rowlands, T. E., Donnelly, R. Medical therapy for intermittent claudication. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 34, 314-321 (2007).
- Cronewett, J. L. . Acute limb ischemia and lower extremity chronic arterial disease: Rutherford’s vascular surgery (8th ed.). , (2014).
- Dick, F., et al. Surgical or endovascular revascularization in patients with critical limb ischemia: influence of diabetes mellitus on clinical outcome. Journal of Vascular Surgery. 45 (4), 751-761 (2007).
- Suárez-Cuenca, J. A., et al. Coronary circulating mononuclear progenitor cells and soluble biomarkers in the cardiovascular prognosis after coronary angioplasty. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (7), 4844-4849 (2019).
- Franz, R., et al. Use of autologous bone marrow mononuclear cell implantation therapy as a limb salvage procedure in patients with severe peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. 50 (6), 1378-1390 (2009).
- Benoit, E., O’Donnell, T. F., Patel, A. N. Safety and efficacy of autologous cell therapy in critical limb ischemia: A systematic review. Cellular Transplantation. 22 (3), 545-562 (2013).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. New England Journal of Medicine. 348 (7), 593-600 (2003).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Smadja, D. M. Early endothelial progenitor cells in bone marrow are a biomarker of cell therapy success in patients with critical limb ischemia. Cytotherapy. 14 (2), 232-239 (2012).
- Kremastinos, D. T., et al. Intracoronary cyclic-GMP and cyclic-AMP during percutaneous transluminal coronary angioplasty. International Journal of Cardiology. 53 (3), 227-232 (1996).
- Truong, Q. A., Januzzi, J. L., Szymonifka, J., Thai, W. E., Wai, B., Lavender, Z. Coronary sinus biomarker sampling compared to peripheral venous blood for predicting outcomes in patients with severe heart failure undergoing cardiac resynchronization therapy: the BIOCRT study. Heart Rhythm. 11 (12), 2167-2175 (2014).
- Ding, N., et al. Fibrosis and inflammatory markers and long-term risk of peripheral artery disease: The ARIC study. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40 (9), 2322-2331 (2020).
- Potier, L., et al. Plasma copeptin and risk of lower-extremity amputation in Type 1 and Type 2 diabetes. Diabetes Care. 40 (12), 2290-2297 (2019).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol. PLoS One. 5 (1), 13790 (2010).
- Marboeuf, P., et al. Inflammation triggers colony forming endothelial cell mobilization after angioplasty in chronic lower limb ischemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (1), 195-197 (2008).
- Regueiro, A., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in acute cardiovascular events in the PROCELL study: Time-course after acute myocardial infarction and stroke. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 80, 146-155 (2015).
