Прогнозирование ампутации с использованием местных циркулирующих моноядерных клеток-предшественников в ангиопластике пациентов с критической ишемией конечностей
Summary
Ампутация нижних конечностей может произойти даже после ангиопластики затрудненных сосудов при критической ишемии конечностей (CLI). Моноядерные клетки-предшественники (MPCs) отражают сосудистый ремонт. В настоящем протоколе описывается количественная оценка МПЦ из циркуляции, близкой к ангиопластике, и его связь с эндотелиальной дисфункцией и прогнозированием ампутации нижних конечностей.
Abstract
Критическая ишемия конечностей (CLI) представляет собой передовую стадию периферического артериального заболевания. Ангиопластика улучшает приток крови к нижней конечности; однако, некоторые пациенты необратимо прогресс к ампутации конечностей. Степень повреждения сосудов и механизмы сосудистого ремонта являются факторами, влияющими на результат постангиопластики. Моноядерные клетки-предшественники (MPC) реагируют на повреждения и ремонт сосудов, с способностью отражать сосудистые заболевания. Настоящий протокол описывает количественную оценку МПЦ, полученных из кровообращения из сосуда вблизи места ангиопластики, а также его связь с эндотелиальной дисфункцией и его прогностический способность к ампутации конечностей в ближайшие 30 дней после ангиопластики у пациентов с CLI.
Introduction
Периферические артериальные заболевания (ПАД) характеризуются хронической и прогрессирующей сосудистой обструкцией с ограничением кровоснабжения1. В глобальном масштабе, PAD нижних конечностей затрагивает около 10% пожилого населения, в то время как до 7% таких случаев представленыампутации конечностей 2,3.
Критическая ишемия конечностей (CLI) представляет собой наиболее серьезную презентацию PAD1. Пациенты обычно испытывают боль в покое, язвы, или гангрена связано с окклюденых артерий; в то время как клинический прогноз неблагоприятный и характеризуется 30% риск ампутации конечностей и смертности в течение1 года 3,4,5.
Ангиопластика является минимально инвазивной эндоваскулярной процедурой, которая может восстановить приток крови к нижней конечности у пациентов с КЛИ; однако, некоторые пациенты неизбежно потребуется серьезная ампутация конечностей, даже после ангиопластики1,5. Раннее выявление неблагоприятных исходов после ангиопластики является весьма ценным, в связи с возможностью терапии органов.
Традиционные факторы риска могут обеспечить ограниченную прогностический способность для серьезной ампутации конечностей у пациентов с CLI, проходящих ангиопластику6. Патофизиологически-ориентированные биомаркеры представляют собой новые методы с потенциальными клиническими применениями, которые могут привести к особенно полезным при заболеваниях, связанных с сосудистойтравмой 7. В настоящее время участие сотовых популяций, владеющих эндотелиальными ремонтными свойствами, на месте атеросклеротической бляшки, всечаще признается 8,9.
Моноядерные клетки-предшественники (MPC) получены из костного мозга и имеют структурные и функциональные характеристики стволовых клеток с сосудистыми регенеративными способностями. Из-за способности MPC размножаться, мигрировать и проявлять сосудистую приверженность; эти клетки стали хорошими кандидатами, чтобы отразить эндотелиальный ремонт в ответ наишемию 10,11,12. Кроме того, непрерывный интерес к механизмам, лежащим в основе сосудистой травмы побудило изучения прогностический роль местных происходящих биомаркеров, так как они считаются отражением повреждениясосудов и ремонт 7,13,14.
Цель настоящего исследования заключается в том, чтобы описать, как определить количество МПЦ, которые циркулируют близко к сосудистой обструкции у пациентов с КЛИ, проходящих ангиопластику; и как оценить связь между МПЦ с показателями эндотелиальной дисфункции и ампутации конечностей.
По сравнению с прогнозом, основанным на сопутствующих заболеваниях и внутренних сосудистых особенностях, количество местных МЦК показывает специфическую способность прогнозировать клинический исход в отношении эндотелиальной дисфункции и ампутации конечностей. Последовательно, некоторые исследования описали прогностический роль аналогичных биомаркеров во время оценки пациентов с PAD15,16.
На основепредыдущих результатов 7, метод, описанный здесь может быть полезным для раннего выявления населения с риском неблагоприятных сосудистых исходов в нескольких клинических условиях, таких как нижние конечности и ишемической ишемии, инсульт, васкулит, венозный тромбоз и другие, связанные с сосудистой травмы и ремонта.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сбор крови в точном месте сосудистого блока может показать технические трудности; Поэтому мы проводили сбор крови в непосредственной близости от сосудистого блока. Аналогичным образом, количество MPCs близко к сосудистой бляшки, как представляется, весьма динамичным и может возникнуть …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят поддержку Институциональной программы Е015 за проект ID 356.2015.
Materials
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12×75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
References
- Serrano-Hernando, F. J., Martín-Conejero, A. Peripheral artery disease: Pathophysiology, diagnosis and treatment. Revista Española de Cardiología. 60 (9), 969-982 (2007).
- Agarwal, S., et al. Burden of re-admissions among patients with critical limb ischemia. Journal of the American College of Cardiology. 69 (15), 1897-1908 (2017).
- Kolte, D., et al. Thirty-day re-admissions after endovascular or surgical therapy for critical limb ischemia: Analysis of the 2013 to 2014 nationwide re-admissions databases. Circulation. 136 (2), 167-176 (2017).
- Rowlands, T. E., Donnelly, R. Medical therapy for intermittent claudication. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 34, 314-321 (2007).
- Cronewett, J. L. . Acute limb ischemia and lower extremity chronic arterial disease: Rutherford’s vascular surgery (8th ed.). , (2014).
- Dick, F., et al. Surgical or endovascular revascularization in patients with critical limb ischemia: influence of diabetes mellitus on clinical outcome. Journal of Vascular Surgery. 45 (4), 751-761 (2007).
- Suárez-Cuenca, J. A., et al. Coronary circulating mononuclear progenitor cells and soluble biomarkers in the cardiovascular prognosis after coronary angioplasty. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (7), 4844-4849 (2019).
- Franz, R., et al. Use of autologous bone marrow mononuclear cell implantation therapy as a limb salvage procedure in patients with severe peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. 50 (6), 1378-1390 (2009).
- Benoit, E., O’Donnell, T. F., Patel, A. N. Safety and efficacy of autologous cell therapy in critical limb ischemia: A systematic review. Cellular Transplantation. 22 (3), 545-562 (2013).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. New England Journal of Medicine. 348 (7), 593-600 (2003).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Smadja, D. M. Early endothelial progenitor cells in bone marrow are a biomarker of cell therapy success in patients with critical limb ischemia. Cytotherapy. 14 (2), 232-239 (2012).
- Kremastinos, D. T., et al. Intracoronary cyclic-GMP and cyclic-AMP during percutaneous transluminal coronary angioplasty. International Journal of Cardiology. 53 (3), 227-232 (1996).
- Truong, Q. A., Januzzi, J. L., Szymonifka, J., Thai, W. E., Wai, B., Lavender, Z. Coronary sinus biomarker sampling compared to peripheral venous blood for predicting outcomes in patients with severe heart failure undergoing cardiac resynchronization therapy: the BIOCRT study. Heart Rhythm. 11 (12), 2167-2175 (2014).
- Ding, N., et al. Fibrosis and inflammatory markers and long-term risk of peripheral artery disease: The ARIC study. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40 (9), 2322-2331 (2020).
- Potier, L., et al. Plasma copeptin and risk of lower-extremity amputation in Type 1 and Type 2 diabetes. Diabetes Care. 40 (12), 2290-2297 (2019).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol. PLoS One. 5 (1), 13790 (2010).
- Marboeuf, P., et al. Inflammation triggers colony forming endothelial cell mobilization after angioplasty in chronic lower limb ischemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (1), 195-197 (2008).
- Regueiro, A., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in acute cardiovascular events in the PROCELL study: Time-course after acute myocardial infarction and stroke. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 80, 146-155 (2015).
