Förutsäga amputation med hjälp av lokala cirkulerande mononukleära stamceller hos angioplastikbehandlade patienter med ischemi i kritiska extremiteter
Summary
Amputation i nedre delen kan förekomma även efter angioplastik av blockerade kärl i Critical Limb Ischemia (CLI). Mononukleära stamceller (MPC) återspeglar vaskulär reparation. Detta protokoll beskriver kvantifiering av MPCs från cirkulation nära angioplastik, och dess samband med endotel dysfunktion och förutsägelse av nedre delen amputation.
Abstract
Kritiska lem ischemi (CLI) representerar ett avancerat stadium av perifera kranskärlens sjukdom. Angioplastik förbättrar blodflödet till nedre delen; vissa patienter irreversibelt framsteg till lem amputation. Omfattningen av vaskulär skador och mekanismerna för vaskulär reparation är faktorer som påverkar post-angioplasty resultatet. Mononukleära stamceller (MPC) är reaktiva för vaskulär skador och reparation, med förmågan att återspegla vaskulär sjukdomar. Detta protokoll beskriver kvantifiering av MPCs erhålls från blodcirkulationen från kärl nära angioplasty webbplats, liksom dess samband med endotel dysfunktion och dess prediktiv förmåga för lem amputation under de närmaste 30 dagarna efter angioplastik hos patienter med CLI.
Introduction
Perifer arteriell sjukdom (PAD) kännetecknas av en kronisk och progressiv vaskulär obstruktion med begränsning avblodtillförseln 1. På global nivå påverkar PAD av de nedre extremiteterna cirka 10% av den äldre befolkningen, medan upp till 7% av sådana fall lämnas in till lem amputation2,3.
Critical Limb Ischemia (CLI) representerar den allvarligaste presentationen av PAD1. Patienter upplever vanligtvis smärta i vila, sår eller kallbrand som kan hänföras till ocklusionerade artärer; medan klinisk prognos är ogynnsam och kännetecknas av en 30% risk för lem amputation och dödlighet under 1 år3,4,5.
Angioplastik är ett minimalt invasivt endovaskulärt förfarande som kan återställa blodflödet till nedre delen hos patienter med CLI. emellertid, vissa patienter kommer oundvikligen att kräva stora lem amputation, även efter angioplastik terapi1,5. Tidig identifiering av ogynnsamma resultat efter angioplastik är ganska värdefullt, på grund av möjligheten till terapi verkställighet.
Traditionella riskfaktorer kan ge en begränsad prediktiv förmåga för större lem amputation hos patienter med CLI genomgår angioplastik6. Patofysiologiska orienterade biomarkörer representerar nya metoder med potentiella kliniska tillämpningar, vilket kan resultera specifikt användbart vid sjukdomar relaterade till kärlskada7. Numera har deltagandet av cellulära populationer som äger endotelreparationsegenskaper, på platsen för den aterosklerotiska plack, alltmererkänts 8,9.
Mononukleära stamceller (MPC) härrör från benmärgen och egna strukturella och funktionella egenskaper hos stamceller med vaskulär regenerativa förmågor. På grund av MPC: s förmåga att föröka sig, migrera och visa vaskulär vidhäftning; dessa celler har blivit bra kandidater att återspegla endotel reparation som svar på ischemi10,11,12. Dessutom har kontinuerligt intresse för mekanismer som ligger till grund för kärlskada motiverat att utforska den prognostiska rollen hos lokala förekommande biomarkörer, eftersom de anses återspegla vaskulär skada och reparation7,13,14.
Syftet med denna studie är att beskriva hur man bestämmer mängden MPC som cirkulerar nära vaskulär obstruktion hos patienter med CLI som genomgår angioplastik; och hur man utvärderar förhållandet mellan MPCs med indikatorer på endotel dysfunktion och lem amputation.
Jämfört med prognosen baserat på komorbiditeter och inneboende vaskulär funktioner, visar mängden lokala MPCs specifika förmåga att förutsäga kliniska resultatet när det gäller endotel dysfunktion och lem amputation. Konsekvent har vissa studier beskrivit den prognostiska rollen hos liknande biomarkörer under utvärderingen av patienter med PAD15,16.
Baserat på tidigare resultat7, den metod som beskrivs här kan vara användbar för en tidig identifiering av population i riskzonen för negativa vaskulär resultat i flera kliniska inställningar, såsom nedre delen och födans ischemi, stroke, vaskulit, venös trombos och andra som involverar vaskulär skada och reparation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Blodsamling på den exakta platsen för kärlblocket kan visa tekniska svårigheter; Därför utförde vi blodsamling i närheten av kärlblock. På samma sätt verkar mängden MPCs nära vaskulär plack vara mycket dynamisk och kan härleda variationer före och efter angioplastik. Enligt våra observationer rekommenderas att utvärdera baslinje- och 30min-post-angioplasty förändringar i antalet MPCs, eftersom de kan återspegla flera patofysiologiska processer som förekommer inom vaskulär skador och reparation.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar stödet från det institutionella programmet E015 för projekt-ID 356.2015.
Materials
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12×75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
References
- Serrano-Hernando, F. J., Martín-Conejero, A. Peripheral artery disease: Pathophysiology, diagnosis and treatment. Revista Española de Cardiología. 60 (9), 969-982 (2007).
- Agarwal, S., et al. Burden of re-admissions among patients with critical limb ischemia. Journal of the American College of Cardiology. 69 (15), 1897-1908 (2017).
- Kolte, D., et al. Thirty-day re-admissions after endovascular or surgical therapy for critical limb ischemia: Analysis of the 2013 to 2014 nationwide re-admissions databases. Circulation. 136 (2), 167-176 (2017).
- Rowlands, T. E., Donnelly, R. Medical therapy for intermittent claudication. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 34, 314-321 (2007).
- Cronewett, J. L. . Acute limb ischemia and lower extremity chronic arterial disease: Rutherford’s vascular surgery (8th ed.). , (2014).
- Dick, F., et al. Surgical or endovascular revascularization in patients with critical limb ischemia: influence of diabetes mellitus on clinical outcome. Journal of Vascular Surgery. 45 (4), 751-761 (2007).
- Suárez-Cuenca, J. A., et al. Coronary circulating mononuclear progenitor cells and soluble biomarkers in the cardiovascular prognosis after coronary angioplasty. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (7), 4844-4849 (2019).
- Franz, R., et al. Use of autologous bone marrow mononuclear cell implantation therapy as a limb salvage procedure in patients with severe peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. 50 (6), 1378-1390 (2009).
- Benoit, E., O’Donnell, T. F., Patel, A. N. Safety and efficacy of autologous cell therapy in critical limb ischemia: A systematic review. Cellular Transplantation. 22 (3), 545-562 (2013).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. New England Journal of Medicine. 348 (7), 593-600 (2003).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Smadja, D. M. Early endothelial progenitor cells in bone marrow are a biomarker of cell therapy success in patients with critical limb ischemia. Cytotherapy. 14 (2), 232-239 (2012).
- Kremastinos, D. T., et al. Intracoronary cyclic-GMP and cyclic-AMP during percutaneous transluminal coronary angioplasty. International Journal of Cardiology. 53 (3), 227-232 (1996).
- Truong, Q. A., Januzzi, J. L., Szymonifka, J., Thai, W. E., Wai, B., Lavender, Z. Coronary sinus biomarker sampling compared to peripheral venous blood for predicting outcomes in patients with severe heart failure undergoing cardiac resynchronization therapy: the BIOCRT study. Heart Rhythm. 11 (12), 2167-2175 (2014).
- Ding, N., et al. Fibrosis and inflammatory markers and long-term risk of peripheral artery disease: The ARIC study. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40 (9), 2322-2331 (2020).
- Potier, L., et al. Plasma copeptin and risk of lower-extremity amputation in Type 1 and Type 2 diabetes. Diabetes Care. 40 (12), 2290-2297 (2019).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol. PLoS One. 5 (1), 13790 (2010).
- Marboeuf, P., et al. Inflammation triggers colony forming endothelial cell mobilization after angioplasty in chronic lower limb ischemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (1), 195-197 (2008).
- Regueiro, A., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in acute cardiovascular events in the PROCELL study: Time-course after acute myocardial infarction and stroke. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 80, 146-155 (2015).
