Genetics

사카로미세스 cerevisiae에서 연대 수명을 조절하는 유전 링크의 특성화를 위한 억제기 스크린

Published: September 17, 2020 doi: 10.3791/61506

Christie Dix¹, Susan Sgro¹, Anup Patel¹, Carly Perrotta¹, Noor Eldabagh¹, Katherine L. Lomauro¹, Fredy W. Miguez¹, Prianka Chohan¹, Charmi Jariwala¹, James T. Arnone¹

¹Department of Biology, William Paterson University

Summary

다음은 Saccharomyces cerevisiae에서증가 된 복사 번호 억제기 화면을 통해 유전 적 상호 작용을 식별하는 프로토콜입니다. 이 방법을 통해 연구자들은 단명한 효모 돌연변이체에서 억제제를 식별, 복제 및 테스트할 수 있습니다. 우리는 autophagy null 돌연변이의 수명에 SIR2의 복사 수 증가의 효과를 테스트합니다.

Abstract

노화는 사망 확률을 높이는 유기체의 정상적인 생물학적 과정의 시간 의존적 악화입니다. 많은 유전 적 요인은 정상적인 노화 과정의 변경에 기여합니다. 이러한 요인은 많은 유기체에서 확인되고 보존된 문서화된 링크의 부에 의해 입증된 바와 같이 복잡한 방법으로 교차합니다. 이 연구의 대부분은 기능상실, 동시에 많은 유전자의 신속한 스크리닝을 허용하는 널 돌연변이에 초점을 맞추고 있습니다. 이 과정에서 유전자의 과발현 역할을 특성화하는 데 초점을 맞춘 작업이 훨씬 적습니다. 본 연구에서는 신진 효모인 사카로미세스 세레비시아에있는 유전자를 식별하고 복제하는 간단한 방법론을 제시하며, 많은 유전적 배경에서 볼 수 있는 단명한 연대순수 의 억제 연구를 위해. 이 프로토콜은 다양한 배경과 다양한 학술 단계에서 연구원이 접근 할 수 있도록 설계되었습니다. HIStone deacetylase에 대 한 코드 SIR2 유전자, pRS315 벡터에서 복제에 대 한 선택 되었다, 연대 순수에 미치는 영향에 충돌 하는 보고서가 있다. SIR2는 또한 전사 인자 ATG1을포함하여 몇몇 유전자의 삭제를 통해 중단될 때 결과되는 autophagy에 있는 역할을 합니다. 원칙의 증거로, 우리는 SIR2 유전자를 복제하여 자가절 결핍 atg1Δ 돌연변이의 단축된 수명 표현형 특성상 억제기 화면을 수행하고 그렇지 않으면 동종, 야생형 유전배경과 비교한다.

Introduction

노화는 궁극적으로 유기체 죽음의 확률을 증가 무수한 생물학적 과정에서 무결성의 시간 의존 손실이다. 노화는 모든 종에 거의 피할 수 없습니다. 세포 수준에는 유전체 불안정, 후성 유전학 적 변화, 프로테오스타증 손실, 미토콘드리아 기능 장애, 규제 완화 된 영양소 감지, 세포 노화 및 텔로미어 감소^1,^,^2를포함하여 노화와 관련된 몇 가지 잘 특징적인 특징이 있습니다. 효모와 같은 단일 세포 유기체에서, 이것은 복제 잠재력 및 연대기 수명 범위^3,^4의감소로 이끌어 냅니다.⁴ 이러한 세포 변화는 암, 심부전, 신경 변성, 당뇨병 및 골다공증^,^5,^6,⁶^7을포함하는 병리학으로 인간같이 더 복잡한 유기체에서 명시됩니다. 노화 과정을 특징짓는 많은 복잡성에도 불구하고, 널리 발산되는 유기체^8,^,^9,^,^10에걸쳐 이 과정의 근간이 되는 이러한 분자 특징의 보존이 있다. 노화 중 이러한 경로에 대한 변경의 식별은 그들이 라이프 스타일 변화를 통해 조작 될 수 있다는 실현을 주도 - 식이 제한은 실질적으로 많은 유기체에서 수명을 연장하는 것으로 나타났다^11. 이러한 경로는 서로 와 다른 많은 통로와 수렴 하고 복잡한 방법으로 교차합니다. 이러한 상호 작용의 용해 및 특성화는 수명과 건강 기간을 연장하기 위한 치료 적 개입 가능성을 제공한다^12,^,^13,^,^14.

노화의 분자 기초의 보존은 신진 효모, Saccharomyces cerevisiae^15,^,^16을포함하여 간단한 모형 유기체의 사용을 통해 프로세스의 근본적인 유전 상호 작용의 기능적 해부를 허용합니다. 신진 효모에 의해 모델링 된 노화의 두 가지 유형이 있습니다 : 연대순 노화 (연대순 수명, CLS) 및 복제 노화 (복제 수명, RLS)^17. 연대순 노화는 세포가 비분할 상태에서 살아남을 수 있는 시간을 측정합니다. 이것은 뉴런^4와같은 G_0에서그들의 생활의 대부분을 보내는 세포에서 보이는 노화와 유사합니다. 대안적으로, 복제 수명은 세포가 고갈 되기 전에 나눌 수 있는 횟수이며 미토티컬 활성 세포 유형(예를 들어, 세포가 가질 수 있는 딸 세포의 수)에 대한 모델이다(예를 들어, 세포가 가질 수 있는 딸 세포의^수).18.

이 방법의 전반적인 목표는 S. cerevisiae를사용하여 노화의 유전학의 기능적 해부를 허용하는 프로토콜을 제시하는 것입니다. 우리의 현재 이해를 이끌어 온 많은 연구원에 의해 수행된 많은 우수한 연구 결과가 있는 동안, 신진 연구원이 그들의 학문적 경력초기에 에서 노후화필드에 기여하기 위하여 유효한 많은 기회가 남아 있습니다. 우리는 연구원이 노화의 분야를 더 발전시킬 수 있는 명확한 방법론을 제시합니다. 이 프로토콜은 자신의 새로운 가설을 공식화하고 테스트하는 데 필요한 도구를 제공함으로써 학업 경력의 단계에 관계없이 모든 연구자가 액세스 할 수 있도록 설계되었습니다. 우리의 접근 방식의 장점은 이 방법이 기관에 관계없이 모든 연구자가 쉽게 접근 할 수있는 비용 효율적인 방법이며 일부 프로토콜^(19)에필요한 고가의 특수 장비를 필요로하지 않는다는 것입니다. 스크린의 이 모형을 디자인하는 몇몇 다른 쪽이 있습니다, 이 일에 설명된 접근은 효모의 동소생성 야생 형 긴장에 비교된 연대순 수명에 있는 가혹한 감소를 나타내는 비 필수 유전자의 null 돌연변이를 선별하는 것이 특히 순종합니다.

원칙의 증거로, 우리는 SIR2를복제, 리신 deacetylase 는 과발 표현 할 때 확장 및 단축 CLS를 모두 전시로보고. SIR2 과발현은 최근 와인 제조 효모에서 CLS를 증가시키는 것으로 나타났습니다. 그러나, 몇몇 그룹은 SIR2와 CLS 확장 사이 아무 링크보고, 특징하에 그것의 역할을 떠나^20,^,^21,^,^22. 문학에 있는 이 상충하는 보고 때문에, 우리는 연대순 노화에 있는 SIR2의 역할을 명확히 하기 위하여 독립적인 연구를 추가하기 위하여 이 유전자를 선택했습니다, 있는 경우에. 또한, SIR2 호모로그의 복사 수를 늘리면 선충 웜 모델^{시스템(23)의}수명이 연장됩니다.

Autophagy는^{리소솜(24)에}단백질 및 세포기관과 같은 세포질 제품을 전달하는 세포내 분해 시스템이다. Autophagy는 세포 항상성을 유지하기 위하여 손상된 단백질 및 세포기관을 저하시키는 그것의 역할을 통해 장수에 밀접하게 연결됩니다^25. 자가식의 유도는 많은 유전자의 발현을 오케스트레이션하는 데 달려 있으며, ATG1 유전자의 삭제는 신진^{효모(26)에서}비정상적으로 짧은 CLS를 초래한다. 자가식 및 세포질-야쿠올(곰팡이 리소냐 에 상응하는)^경로(27,^,^28)에서소포 형성에 필요한 단백질 세린/스레오닌 키나아제에 대한 ATG1 코드. 여기에서는 복사 번호 화면 증가에 대한 방법을 제시하여 야생 유형및 atg1-null배경에서 CLS에 대한 SIR2 복사본 증가효과를 테스트합니다. 이 방법은 특히 주로 학부 기관의 주니어 연구원 및 연구 그룹에 순종하며, 그 중 많은 사람들이 과학분야에서 과소 대표되는 지역 사회에 서비스를 제공하고 자원이 제한적입니다.

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Protocol

1. 스크리닝을 위한 잠재적인 유전적 상호 작용 식별

특성화를 위한 유전적 배경을 식별하여, 이 유기체에 대한 알려진 황소정보를 컴파일하는 사카로미세스 게놈 데이터베이스(SGD, https://www.yeastgenome.org^29,^,^30)를사용하여 사카로미세스 세레비시아에 비정상적으로 짧은 연대순 수명(CLS)을 초래한다.
1. 웹 페이지 상단의 옵션에서 함수 탭을 선택합니다.
2. 표현형을 선택한 다음 모든 표현형 찾아보기를 선택합니다.
3. 효모 표현형 Ontology 옵션에서 개발 하위 제목으로 스크롤하고 수명 하위 제목 아래에 있는 연대순 수명을선택합니다.
4. 삭제될 때 감소된 연대순형표현형을 나타내는 유전자의 식별을 허용하는 감소에대한 한정자를 선택한다. 이 방법의 증명 atg1Δ가 선택되어 단명한 CLS 표현형을 생성하고 autophagy^26에대해 중단된다.
1.2부에서 확인된 돌연변이의 보고 되거나 예측된 온톨로지 속성에 기초하여 표현형을 억제할 수 있는 유전적 상호작용을 선별하기 위해 표적 유전자를 식별한다. 위의 단계 1.1.1-1.1.4 단계에서 찾아낸 표현형 검색을 반복하여 야생 형 배경에서 과발현 될 때 더 긴 CLS를 초래하는 유전자를 쿼리합니다. SIR2는 보고된 CLS 표현형에 기초하여 선택되었으며, 자가phagy^,^31,^32와의상호 작용을 보고했다.

2. 시약 준비

참고: 달리 지정되지 않는 한 각 용액을 121°C에서 20분 동안 사용할 수 있습니다.

YPAD 액체 매체: 2리터당 효모 추출물 1%, 펩톤 2%, 덱스트로스(포도당), 40mg 아데닌(아데닌 황산탈수)을 첨가합니다. 자기 교반기와 잘 섞으세요.
LB 액체 매체: 트립톤(10g), 효모 추출물(5g), 염화나트륨(10g)을 이중 증류수 리터당 추가합니다. 자기 교반기와 잘 섞으세요.
1000x(100 mg/mL) 암피실린 육수를 이중 증류수로 준비합니다. 잘 섞고 필터를 살균합니다.
합성 완료 – 류신 (SC-LEU) 액체 매체: 아미노산을 w/ o, 2% 포도당, 1.92 g의 SC-LEU 드롭아웃 믹스, 이중 증류수 의 리터 당 암모늄 황산염 5 g를 추가합니다. 자기 교반기와 잘 섞으세요.
TE 버퍼: 이중 증류수로 용액에 트리스(10mM 최종 농도), EDTA(1mM 최종 농도)를 혼합합니다. 자기 교반기와 잘 섞으세요.
이중 증류수로 50% PEG 3350용액을 준비합니다. 자기 교반기와 잘 섞으세요.
이중 증류수로 1M 및 100m 리튬 아세테이트 용액을 준비합니다. 자기 교반기와 잘 섞으세요.
참고: 고체 한천 판을 만들기 위해 오토클레이브 전에 2.1 및 2.2로 제조된 미디어에 20g의 한천(이중 증류수가 있는 리터당)을 추가합니다. 암피실린 플레이트를 준비하는 경우 약 60°C로 냉각된 후 위의 2.2에서 암피실린의 1mL을 미디어에 첨가한다. 멸균 접시에 붓고 사용하기 전에 48-72 시간 동안 설정하십시오. 더 긴 보관을 위해 4 °C에 접시를 보관하십시오.

3. PRS315 벡터에 SIR2를 복제하는 복제 전략을 설계

PRS315 벡터로 복제하기 위한 SIR2 유전자를 증폭시키는 PCR 프라이머를 설계한다.
1. SIR2의상류 및 하류간 영역으로 21-22뉴클레오티드 상보성을 수동으로 설계한다. mRNA의 번역되지 않은 영역과 함께 전체 유전자가 사용 가능한 데이터 집합^33,^,^34에서이러한 기능을 매핑하여 복제되는지 확인합니다.
2. PCR 프라이머 설계결과 53°C 이상 및 60°C 이하의 용융 온도(Tm)가 있는 전방 및 역프라이머가 생성되도록 합니다.
  참고: 이상적으로, 두 프라이머는 40-50% 사이의 대략적인 GC 함량으로, 시퀀스 전반에 걸쳐 GC 및 AT 분포의 균형을 피하고, 시퀀스가 허용하는 것과 같이 Tm을 가져야 합니다.
3. 복제용 앰플리시온의 생성을 허용하는 PCR 프라이머의 설계 후, 플라스미드 클로닝 벡터에 호환되는 각 프라이머의 5'끝에 제한 효소 소화(R.E.D.) 표적 부위를 추가한다. 이 방법에서, 힌드III 제한 효소 소화 부위(5'-AAGCTT-3')가 업스트림에 첨가되고, 전방 프라이머 및 SacII 제한 효소 소화 부위(5'-CCGCGG-3')가 다운스트림, 역프라이머에 첨가된다.
  참고: SacII 및 HindIII 사이트의 사용은 각 엔도나클로스에 대한 컨센서스 컷 사이트가 표적 유전자에 존재하지 않도록 요구합니다. 어느 효소가 표적 유전자 내의 표적인 경우에, 대체 제한 효소는 선택되어야 합니다. pRS315 벡터의 폴리링커 영역과 호환되는 많은 것들이 있습니다.
4. 마지막으로, 각 프라이머의 5'말에 4개의 뉴클레오티드(5'-NNNNN-3') 서열을 오버행하여 제한 효소가 앰플리코온을 결합하고 소화할 수 있도록 한다. 프라이머가 설계되면, SIR2 유전자를 복제하는 데 사용하기 위해 상업적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 가지고 있다.
5. PCR 프라이머의 재서스펜션: 최대 속도4분의 탁상 마이크로퍼지를 사용하여 PCR 프라이머원 원심분리기. TE 용액을 추가하여 100 μM의 재고 농도를 만듭니다.
  참고: 100 μM 스톡을 만들려면 TE의 마이크로리터를 사용하여 프라이머 튜브의 10배 분량인 멸균 TE 버퍼의 부피에 프라이머를 용해하십시오. 예를 들어 튜브에 프라이머 15.6 nmoles가 포함되어 있는 경우 TE 버퍼156 μL을 추가합니다.
SIR2 복제 구조의 PCR 증폭을 위해 야생형 효모 gDNA를 분리합니다.
참고: 효모 gDNA를 분리하는 데 몇 가지 고품질 옵션이 시판됩니다. zymolyase와 곰팡이 세포벽의 소화를 포함하는 키트의 활용은 더 나은 품질의 gDNA (더 높은 수율, 적은 불순물)을 초래한다. 아래 프로토콜은 지속적으로 높은 농도와 순도를 반환합니다. 재료 표에서 추천하는 키트의 세부 정보를 찾을 수 있습니다.
1. YPAD와 같은 농축 된 미디어에서 48-72 h의 야생 형 효모의 5 mL 배양을 48-72 h로 성장시다. 실온에서 3분 동안 효모 세포를 >800 x g로 펠렛하고, 성장 매체를 제거하고, zymolyase 의 5 μL (2 단위 효소 /μL)로 보충 된 zymolyase 소화 완충제의 120 μL에서 재중단합니다. 37°C에서 37°C에서 40분 동안 피질및 배양하여 샘플을 섞는다.
2. 차트로픽 용해 완충제(예: 염화물 과니디늄), 250μL의 클로로폼을 추가하고 60초 동안 시료를 소용돌이시다.
3. 원심분리기 >8,000 x g에서 2분 동안 상체를 멸균 수집 튜브의 정화 열로 옮긴다.
4. 60 s에 대한 >8,000 x g에서 원심 분리기와 통해 흐름을 폐기합니다. gDNA는 컬럼 행렬에 바인딩됩니다.
5. 에탄올 기반 세척 버퍼의 300 μL로 컬럼을 두 번 세척하여 원심분리 단계(3.2.4)를 반복합니다. 각 회전 후 흐름을 삭제합니다. 컬럼을 1.5mL 마이크로퍼지 튜브로 옮기고, 60μL의 TE 버퍼를 추가하고, 실온에서 60초 동안 배양한다. 플래시는 DNA를 elute하기 위해 30 s에 대한 샘플을 회전합니다.
  참고: 샘플(260nm의 흡광도)과 품질(흡광도 260nm/280nm)에서 DNA의 농도를 결정합니다. 일반적인 수율은 260nm/280nm에서 흡수율로 gDNA의 100-200 ng/μL이 가능한 한 1.8에 가깝습니다.
복제를 위한 pRS315 플라스미드 벡터를 증폭및 분리한다.
참고: 플라스미드 벡터의 정화를 위해 몇 가지 고품질 옵션을 시판할 수 있습니다. 이 단계에는 실리카 기반 컬럼 화학을 권장합니다. 아래에 명시된 변화는 가장 높은 농도와 순도로 이어졌습니다. 자세한 내용은 재료 표에서찾을 수 있습니다.
1. LB+ 암피실린(80 μg/mL) 배지에서 하룻밤 사이에 pRS315 벡터를 함유한 대장균의 배양 5mL를 성장시다. RT(15-25°C)에서 2분 동안 원심분리에 의한 배양군을 2분 동안 >8,000 x g로 한다.
2. RNase A (100 μg/mL)를 사용하여 250 μL의 TE 버퍼에서 펠릿 세균 세포를 다시 중단하고 미세 원심 분리기 튜브로 이송합니다. 세포의 덩어리가 남아 있지 않은지 확인합니다.
3. 250 μL의 리시스 버퍼를 넣고 튜브를 6-8번 반전하여 섞습니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오. 용해가 5 분 이상 진행되도록 허용하지 마십시오 - 조금 덜 바람직하다.
4. 350μL의 중화 버퍼를 넣고 튜브를 10번 반전시켜 즉시 완전히 섞습니다. 원심분리기 는 10 분 에서 >8,000 x g.
5. 피펫팅을 통해 상체를 위에서 실리카 스핀 컬럼으로 조심스럽게 옮기습니다. 30s의 원심분리기와 흐름을 폐기합니다.
6. 단계 3.3.5와 같이 높은 소금 세척 버퍼와 원심분리기의 500 μL을 추가합니다. 흐름을 삭제합니다. 에탄올 계 세척 버퍼의 750 μL을 추가하여 DNA 결합 스핀 컬럼을 세척하고 잔류염을 제거하고 3.3.5 단계에서와 같이 원심분리기를 제거합니다.
7. 잔류 세척 버퍼를 제거하기 위해 >8,000 x g에서 2 분 동안 흐름을 통해 원심 분리기를 폐기하십시오. 스핀 컬럼을 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 놓습니다. DNA를 elute하려면 스핀 컬럼의 중앙에 20 μL의 TE 버퍼를 추가하고 실온에서 1 분 동안 배양하고 원심 분리기는 >8,000 x g에서1 분 동안 배양합니다.
8. 분광계를 사용하여 DNA의 양(흡광도 260nm/280 nm)을 결정합니다. 일반적인 수율은 1-2 μg/μL입니다.
후진의 PCR 증폭, SIR2, 야생형 게놈 DNA
1. 복제에 적합한 앰플리시온을 생성하려면, 증폭되는 서열내돌연변이의 의도하지 않은 생성을 피하기 위해 고충실도(HF) PCR 폴리머라아제(HIGH-fidelity)를 활용한다.
  참고: 다양한 고충실도 PCR 옵션을 시판할 수 있습니다. PCR 반응 조건의 최적화를 용이하게 하려면 표준 HF 버퍼이고 높은 GC 및 복잡한 앰플리콘에 최적화된 두 버퍼 조합을 사용합니다. 자세한 내용은 재료 표에서찾을 수 있습니다.
2. PCR은 표 1에 설명된 대로 복제를 위한 SIR2 구조를 증폭시합니다.
  참고: 복제 단계의 성공을 극대화하기 위해 동일한 50 μL을 PCR 컬럼 정리 단계로 설정하고 집중할 수 있습니다. gDNA 템플릿 제어 반응(음수 제어)이 없는 하나를 설정해야 합니다.
3. 표 2에 설명된 대로 PCR 사이클링 조건을 설정합니다.
  참고: 다른 프라이머 쌍은 어닐링 온도와 다른 폴리머라제 기능에 따라 다릅니다. 선택한 효소와 설계된 프라이머 조합의 사양에 따라 증폭 조건을 최적화해야 합니다.
4. 1.0% TAE-아가로즈 젤(시각화를 위한 0.5 μg/mL 에티듐 브로마이드)에서 약 2.5 kb의 DNA 단편을 생성하는 PCR 반응을 시각화하여 PCR 반응의 성공을 확인합니다.
후보 유전자의 소화 및 결찰, SIR2,pRS315 플라스미드 벡터로.
1. 벡터 및 인서트의 제한 소화를 수행: 625 ng DNA(벡터 또는 삽입), q.s. 물은 최종 반응 부피를 50 μL, 완충제 5μL, 1 μL SacII 및 1 μL 힌드III로 가져옵니다. 37°C에서 3시간 동안 제한 소화를 배양한 다음 효소를 가열하기 위해 20분 동안 80°C가 됩니다. 다이제스트는 다음 단계로 진행하기 전에 4 °C에서 저장할 수 있습니다.
2. 원하는 플라스미드를 만들기 위해 15 μL 결찰 반응을 설정: 멸균수 6μL, 소화 벡터 2개(50 ng DNA), 4 μL 소화 인서트(100 ng DNA), 2 μL T4 반응 버퍼, T4 DNA 리간아제 1μL. 16°C에서 하룻밤 동안 결찰 반응을 배양하고, 효소를 가열하기 위해 20분 동안 80°C가 됩니다.
  참고: 삽입 대신 멸균 수(총 10μL)의 추가 4μL을 대체하여 인서트 제어를 설정하지 않습니다.
3. 결찰 반응을 대장균으로 변환합니다.
  참고: 유능한 셀에 사용할 수 있는 많은 옵션이 있습니다. 이 프로토콜은 사용하기 전에 -80 °C에 저장되는 화학적으로 유능한 세포를 사용합니다.
  1. 얼어붙은 유능한 대장균 세포의 50 μL 튜브를 얼음 위에 해동할 때까지 해동하고 즉시 결찰 반응의 15 μL을 추가합니다. 튜브를 여러 번 쓸어 넘깁니다. 즉시 튜브를 얼음으로 돌려보내 30분 동안 배양합니다.
  2. 정확히 42 °C에서 수조에서 20 초 동안 세포를 열 충격시키고 즉시 튜브를 얼음으로 돌려 2 분 배양합니다. 각 변형 반응에 450 μL의 실온 회수 매체(예를 들어 SOC 또는 LB)를 추가하고 흔들림으로 37°C에서 60분 동안 배양합니다.
  3. 각 변환 반응에 대해 세포의 1:10 희석을 합니다. 멸균 기술을 사용하여, 희석되지 않은 세포의 플레이트 150 μL및 LB +(80 μg/mL) 암피실린^{플레이트(35)에}1:10 희석제. 하룻밤 사이에 플레이트를 37°C에서 배양합니다.
과발현 벡터에 대한 화면 잠재 변환제를 검사합니다.
1. 멸균 기술을 사용하여 5mL LB + (80 μg /mL) 암피실린으로 자라나는 잠재적 인 변압제를 접종하고 하룻밤 사이에 자랍니다. 위의 섹션 3.3.1-3.3.7에 설명된 절차에 따라, 모든 잠재적 인 변압제와 화면에서 플라스미드를 분리하여 제한 소화에 의해 삽입을 성공적으로 통합한 다음 1.0 % TAE-agarose 젤 (0.5 μg/mL 에티듐 브로마이드)에 겔 전기 포에 의해 삽입을 성공적으로 통합합니다.

4. 벡터를 atg1Δ 및 야생 형 효모 균주로 변환

참고: 이것은 수정된 리튬 아세테이트 변환^{프로토콜(36)을}사용하여 수행됩니다.

15mL의 야생형 및 atg1-null효모 세포는 YPAD 매체에서 하룻밤 사이에 재배되어 초기에서 중반 로그 단계(O.D. 600nm = 0.4-0.9)까지 실온에서 3분 동안 3분 동안 성장하였다. x g
상체를 데수, 멸균 ddH₂O의 1mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 내용물들을 1.7mL 마이크로퍼지 튜브로 전송한다. 실온에서 > 800 x g에서 3 분 동안 세포를 펠렛.
상체를 제거하고 부드러운 파이펫팅으로 100mM 리튬 아세테이트의 250 μL에서 세포를 다시 중단합니다. 세포를 수행 할 각 변환에 대해 별도의 미세 분리 튜브로 분할합니다. 변환당 셀 리튬 아세테이트 믹스의 50 μL을 사용하십시오.
변환 믹스를 설정합니다. 각 변형에 추가: 50% PEG3350의 240 μL, 1.0 M 리튬 아세테이트의 36 μL, 그리고 5 μL 의 연어 정자 (또는 다른 캐리어) DNA, 5 분 동안 및 얼음에 삶은.
참고 : PEG는 매우 점성입니다. 파이펫과 신중하게 측정합니다. 이동하기 전에 각 구성 요소를 추가한 후 파이펫팅하여 섞는다.
수행된 각 변환에 대해 적절한 플라스미드의 5 μL을 추가합니다. 각 튜브가 완전히 섞이도록 소용돌이합니다. 샘플을 30°C에서 45분 동안 배양합니다. 10 분 동안 42 °C에서 열 충격 샘플.
펠릿 셀은 실온에서 3분 동안 > 800 x g, 변형 믹스를 주의 깊게 제거하고, 위의 스핀을 반복하여 멸균 ddH₂O. 펠릿 세포의 300 μL에서 샘플을 다시 일시 중단하고, 신중하게 물을 제거하고, 멸균 ddH_2O의200μL에서 샘플을 다시 중단합니다.
효모의 각 변형 된 변형 된 변형 된 균주에 대해 1/10 및 1/100 희석을 설정합니다.
각 샘플에서 150 μL의 멸균 기술 판을 사용하여 SC-류신 플레이트에 사용하여 플라스미드를 선택합니다. 세포를 균일하고 균일하게 퍼뜨리고 플레이트가 반전및 30°C에서 배양하기 전에 건조하여 48-72h동안 자랄 수 있도록 한다.
참고: 적절한 균주가 생성되면 -80°C에서 25% 글리세롤에 장기간 보관할 수 있다. 존재하는 카피 번호의 정량화는 qPCR, RNA-FISH, 또는 다른 적절한 측정^37,^,^38을포함하는 몇몇 방법론에 의해 결정될 수 있다.

5. 단축된 CLS 표현형 억제를 테스트하기 위해 연대순 수명을 결정합니다.

단명효, atg1Δ 돌연변이에서 CLS에 대한 퍼티제 억제제의 과발현 효과를^{시험하여, 시간(39)의}함수로 남아 있는 콜로니 형성 유닛(CFU)의 수를 결정한다.
참고: 실험의 이 부분을 적절한 컨트롤로 설정해야 합니다. 일반적인 실험은 효모의 야생 유형(WT) 변형을 빈 벡터와 비교하고, WT는 억제기 벡터를, 빈 벡터를 가진 삭제 돌연변이, 및 억제기 벡터를 가진 삭제 돌연변이를 비교합니다.
1. SC-LEU 미디어에 변형의 단일 식민지를 연구하고 접종하십시오. 72시간 동안 30°C에서 배양을 성장시키고 흔들어 보시고 있습니다.
2. 혈종계를 사용하여^{배양(40)에}존재하는 세포의 농도를 결정한다.
3. 배양물의 알리쿼트(aliquot)를 희석하여, 그 결과 멸균수의 150μL 부피에서 균일한 수의 세포가 되도록 한다. 멸균 기술을 사용하여 배양을 SC-LEU 플레이트에 플레이트하고 72h의 30°C에서 자랍니다. 이 플레이트는 3일 시점에서 실험이 100% 생존가능성^39로이 시점까지 정규화된다.
  참고: 셀 수는 200-500이어야 하며, 분석에 충분히 크고 계산을 위한 관리 가능한 수여야 합니다. 이 연구에서는 도금 수량에 200개의 세포를 사용했습니다.
4. 5.1.3에 설명된 대로 일반 알리쿼트와 도금을 복용하여 30°C에서 효모 배양을 계속 배양합니다. 균주가 더 이상 실행 가능하지 않은 때까지 이 프로세스를 계속 한 다음 결과를 컴파일하고 분석합니다.
  참고: 이 연구에서 사용되는 균주의 전체 목록은 표 3에서찾을 수 있습니다.

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Representative Results

노화 중 SIR2의 역할에 대한 상반되는 보고가 있기 때문에, 우리는 atg1Δ 돌연변이의 단축 CLS 표현형^26의잠재적 억제제로 연구를 위한 이 유전자를 선택했습니다. SIR2의 역할은 CLS 확장의 역할에 대한 상반되는 보고서와 함께 다소 논란의 여지가 있지만, 적어도 하나의 효모 배경에서 CLS 증가와 분명히 연결되어 있으며, autophagy 및 mitophagy^22,^31,^,^32,^,⁴¹모두에서 역할을하고 있습니다.^,

플라스미드 벡터의 우리의 선택은 신진 효모와 박테리아⁽⁴²⁾모두에서 유전 조작, 전파 및 유지 보수의 용이성을 위해 만들어진 pRS315 셔틀 벡터입니다. 이러한 벡터는 LEU2 영양 마커, T7 및 T3 프로모터를 포함하고, 세포^분열(42)동안 안정적인 통로를 위한 센트로메릭(CEN) 벡터이다.CEN 미토세포 분열에 걸쳐 이 벡터의 안정성은^{영양마커(42)에}의해 다른 동생 벡터와 비교했을 때 더 바람직하였다. pRS315 벡터에는 CEN과 결합된 자율 복제 서열이 포함되어 있어 세포^{집단(43)의}내외의 낮고 일관된 플라스미드 수준을 유지한다.

SIR2 유전자및 상응하는 상류(5' UTR) 및 하류(3' UTR) 게놈 영역의 DNA 서열이^33개얻어졌다. 전사된 유전자가 단백질 제품의 안정성과 번역을 위해 필요한 구성 요소 인 UTR을 포함하도록 하기 위해 초기 창은 +/-400 bp였습니다. 이 창은 이 영역 내의 뉴클레오티드 조성물에 기초하여 +/- 500bp로 확장되었습니다. 각 프라이머의 5'엔드에 첨가된 제한 소화 부위와 4뉴클레오티드 오버행을 통합하여 유전자 및 해당 조절 영역의 증폭을 허용하는 PCR 프라이머를 설계했습니다(도1A). PCR에 의한 이 부위의 성공적인 증폭은 DNA 단편 2.469 kb길이(도 1B)를초래한다.

SIR2는 PCR에 의해 증폭되었고, 이 반응의 제품은 아가로즈 젤 전기포에 의해 시각화되었고 템플릿 제어반응(도 2)에비해. SIR2 증폭은 게놈 DNA 템플릿을 가진 두 차선에서 보였다; 두 반응은 풀과 집중되었다. 대장균으로부터 pRS315의 플라스미드 정제가 수행되었으며, 이는 아가로즈 겔 전기포에 의해 시각화되었다(도3). 샘플은 분광측법에 의해 정량화되었고, 변압제 #2 플라스미드 준비는 256 ng/μL(OD_260/280 = 1.87)의 농도를 가진 복제를 위해 선택되었다.

플라스미드와 인서트는 힌드III와 SacII로 소화되고, 함께 결합하고, 증폭 및 검진을 위해 대장균으로 변형되었다. 이러한 제한 소화 사이트를 선택하려면 해당 지역에 어느 사이트가 없는지 확인해야 합니다. 하나의 (또는 둘 다) 부위의 존재는 SIR2 유전자를 복제하기 위해 대체 제한 효소의 사용을 필요로하고, pRS315 폴리링커 영역^(42)에서선택할 수있는 몇 가지가 있다.

힌드III 및 SacII를 통해 이중 소화에 의한 삽입을 절제하여 pRS315-SIR2 벡터를 성공적으로 생성한 후 아가로즈젤(도 4)에대한 시각화를 성공적으로 생성하기 위한 변압제를 선별하였다. pRS315-SIR2 벡터는 CLS 특성화에 사용되는 균주를 생성하기 위해 야생 형 및 atg1Δ 돌연변이체로 변환되었다. pRS315 벡터는 널리 사용되고 특징화된 고전적인 벡터이며, 이는 이 특정 시스템의 장점 중 하나입니다. 상대적 복사 번호는 qPCR(도 5)에 의해 결정되었다(도5)이전에 설명된 바와^같이(37). 이로 인해 셀당 평균 1개에서 셀당 평균 2.5부로 복사 수가 소폭 증가하여 이전^{보고서(42)와}일치합니다.

atg1Δ+pRS315-SIR2의 연대순 수명은삽입(atg1Δ+pRS315) 대신 빈 벡터를 함유하는 효모의 동종 균주와 비교하였다. 노화 배양은 일관되고 동등한 희석으로 도금되었고 이미징 및 정량화(도6A)에앞서 30°C에서 72시간 동안 재배되었다. 성장한 식민지 형성 단위의 수는 3일째(첫 번째 촬영)로 결정되고 정상화되고 플롯되었다(도6B). 우리는 atg1Δ 배경에서 CLS에 우리의 SIR2 구조의 통계적으로 유의한 효과가 없다고 보고합니다. 또한, 우리는 야생 형 배경에서 CLS의 확장을 볼 수 없었다 – 여기서 우리의 겸손한 SIR2 과발현실제로 빈 벡터 제어에 비해 CLS의 감소를 생산(도 6B).

그림 1: SIR2를복제하는 구문 설계. SIR2 유전자를 측면시키는 게놈 영역은 유전자의 증폭 및 복제를 위한 PCR 프라이머를 설계하는 데 활용되었다. 프라이머는 유전자(FP)의 상류에 대한 419기쌍의 상류와 351개의 염기 쌍(RP), 힌드III 또는 SacII 제한 소화 부위 및 4-뉴클레오티드오버행(A)을함유하고 있다. 해당크기(B)와함께 SIR2 genic 영역을 복제하도록 설계된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 생성된 앰플리코의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: 겔 전기포고증에 의해 시각화된 SIR2 유전자의 PCR 증폭. SIR2 유전자를 증폭시키는 고충실도 PCR 반응의 제품은 1% 아가로즈 젤(에티듐 브로마이드)에 시각화되었다. 전자약진을 템플릿(+)으로 사용하여 중복 반응을 수행했으며 템플릿 제어(-)와 비교하였다. 예상 앰플리카 크기는 2.469 kb입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: 젤 전기포고증에 의한 pRS315 벡터의 시각화. 중복 정제 된 플라스미드 반응이 수행되고 1 % 아가로즈 젤 (에티듐 브로마이드)에 시각화되었다. pRS315 벡터의 크기는 6.018 kb입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: 젤 전기경전경에 의한 pRS315-SIR2 벡터에 대한 스크리닝. pRS315-SIR2 벡터를 포함하는 잠재적 인 변압제는 힌드III와 SacII로 소화 된 다음 1 % 아가로즈 젤 (에티듐 브로마이드)에 시각화되었습니다. 벡터의 성공적인 생성은 5.963 kb(pRS315 백본) 및 2.461 kb(SIR2 유전자)에서 대역을 산출한다. 두 개의 잠재적 인 변환제를 빈 벡터 컨트롤과 비교했습니다. 변압제 #1 pRS315-SIR2 벡터에서 예상되는 패턴을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: pRS315-SIR2 벡터는 야생 형 효모 배경에서 SIR2 복사 번호를 증가시킵니다. 야생형 유전적 배경에 존재하는 SIR2 사본의 수는 정량적 PCR에 의해 결정되었다. 값은 내부^{제어(44)로}선택된 ACT1을 사용하여^2-ΔΔCt 방법을 사용하여 계산하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: atg1Δ+pRS315-SIR2의연대순 수명. CLS는 시간의 함수로서 실행 가능한 식민지 형성 단위의 수를 정량화함으로써 결정되었다. 효모의 노화 배양은 500 세포/플레이트로 희석되었고이미징(A)에앞서 30°C에서 72시간 동안 재배하였다. 데이터는 3일로 정규화되고시각화(B)를위해 플롯되었습니다. EV는 빈 벡터(삽입 없음 pRS315)이고 SIR2O/E는인서트(pRS315-SIR2)를포함한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

구성 요소	최종 농도
뉴클레아제 없는 물	Q.S. 최종 볼륨까지
버퍼	1X
dNTP (conc: 10mM)	200uM
포워드 프라이머 (conc: 10μM)	0.5μM
역프라이머(conc: 10μM)	0.5μM
템플릿 gDNA	100-200ng
HF 폴리머라제	1 단위/50μL PCR

표 1: PCR 반응 구성 요소.

단계	임시	시간
초기 성하	98°C	2분
사이클링	98°C	30대
(35사이클)	53-60°C(프라이머 별)	30대
	72°C	kB당 30대
최종 확장	72°C	5-10m
개최	10°C	무기한

표 2: PCR 사이클링 조건.

스트레인:	부모:	플로이디:
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 + pRS315 (LEU 벡터)	BY4741	하플로이드
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 + pRS315-SIR2 O/E (LEU 벡터)	BY4741	하플로이드
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0atg1Δ + pRS315 빈 벡터 (LEU 벡터)	BY4741	하플로이드
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0atg1Δ + pRS315-SIR2 O/E (LEU 벡터)	BY4741	하플로이드

표 3: 사용되는 균주.

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Discussion

노화의 유전학을 해명하는 것은 어려운 도전이다, 잠재적으로 존재하는 복잡한 상호 작용에 상당한 통찰력을 얻을 수있는 추가 연구를위한 많은 기회와. ^{효모(45)의}^,널 균주의 연구를 위한 기능 상실 돌연변이의 신속한 발생을 허용하는 많은 방법이^있다. 이 방법은 과발현 억제기 연구를 위한 pRS315 벡터에 유전자를 확인하고 복제하는 간단한 접근 법을 제시합니다. 이 접근법의 한 가지 장점은 이것이 염색체^{통합(47)의}사용으로 인해 발생할 수 있는 예기치 않은 문제를 피할 수 있는 안정적인 벡터로부터 중간 초과 표현을 허용한다는 것입니다. 이 접근은 그들의 과학 적인 경력의 각종 수준에서 연구원의 모집을 격려하는 방식으로 제시됩니다, 그들의 교육의 한 구성 요소로 퍼티티 억제기의 식별 그리고 복제를 통해 기여하는 이 간행물에 저자의 많은.

이 작품에서, 우리는 변경된 연대수에 유전 링크, 원하는 표현형을 확인하기 위해 Saccharomyces 게놈 데이터베이스에 컴파일 된 데이터의 재산을 사용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 짧은 수명 자가 절핍 돌연변이의 CLS에 중간 과발현의 효과를 테스트하기 위해 pRS315 벡터로 SIR2를 복제, atg1Δ. 17일 의 노화 시간 과정 전반에 걸쳐 자가 돌연변이의 CLS와 야생 형 배경에서 볼 수있는 더 가속화 된 CLS에 영향을 미치지 못했습니다. 이는 SIR2의 적당한 복사 수 증가가 atg1Δ 돌연변이 배경에서 CLS에 영향을 미치지 않는 것으로 해석될 수 있다. ATG1은 자가식을 유도하는 데 필요한 전사 인자이기 때문에, 우리의 결론은 자가식 통로의 개시로 제한됩니다. 추가적으로, 우리는 우리의 야생 모형 유전 배경에 있는 CLS에 증가를 볼 수 없습니다 - 아마도 SIR2의 사본 수를 증가시키는 표현형을 확장하는 CLS가 특정 유전 배경에 특정일 지도 모르고 유비쿼터스되지 않다는 것을 건의합니다.

이 프로토콜 내의 중요한 단계에는 CLone에 대한 SIR2 구문의 적절한 설계와 리그레이션을 최적화하기 위한 적절한 조건이 포함됩니다. 이러한 단계를 트러블슈팅하는 것은 CLS 분석기를 통해 특성화를 위한 유전자를 복제하는 데 필요할 수 있다. 이 방법의 한 가지 제한은 플라스미드를 유지하고 세포 주기를 다시 입력 할 수있는 세포를 선택한다는 것입니다. 이것은 피트 니스의 마커, 그것은 노화 표현형을 해부 하는 보완적인 접근 방식을 사용 하 여 후속 연구에 대 한 필수적 이다. 이것은 플라스미드 보존에 의존하지 않는 접근뿐만 아니라 중요한 염료 염색에 의한 세포 생존력의 정량화를 포함할 수 있습니다. 노화 된 세포의 각화^,또는 복제 수명^48,^,^49,^50의특성화를 통해 CLS의 추가 특성화를 입증하는 우수한 방법이 있습니다. 추가적으로, 우리의 접근은 비 치명적인 상호 작용의 확인에 국한되고, 치명적인 표현형에 있는 결과를 초래하는 유전자를 복제하는 성공적인 시도를 가진 유전자를 복제하는 실패한 시도를 분화하는 것은 도전적일 것입니다.

우리의 접근은 추가 연구를 위한 유전자 putative 유전 상호 작용의 확인을 위해 유용합니다. 그것은 간단하고 간단하고, 지금까지, 우리는 SIR2, AIF1, UBI4및 MDH1을 복제하기 위해이 방법을 사용하고 이러한 구조의 각각을 통해 연구를 후속하는 과정에있습니다. 이 기술은 이 일에서 프로토콜 개요를 따라서 유전 상호 작용의 수를 특성화하기 위하여 적용될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

제임스 T. 아르논은 2017년과 2018년 윌리엄 패터슨 대학교에서 이 프로젝트에 참여했지만, 크리스토퍼 안디노, 후안 보테로, 조세핀 보잔, 브렌다 칼알파, 브렌다, 데다, 헤즈러브, 헤즈러브, 헤즈러브, 헤즈러브 , 웨인 코, 넬슨 메지아, 헥터 모톨라, 라비아 나즈, 압둘라 오데, 진주 파군탈란, 다니엘 라자에, 가브리엘라 레토르, 에이다 쇼노, 매튜 소. 당신은 위대한 과학자이고 나는 당신을 모두 그리워!

저자는 그들의 도움을 윌리엄 패터슨 대학에서 교육 및 연구 기술의 귀중한 지원을 인정하고 싶습니다: 그렉 매티슨, 피터 칸나로지, 롭 마이어, 단테 포르텔라, 헨리 하이니츠. 저자는 또한 예술 지원을위한 프로보스트의 사무실, 학장사무실 및 과학 및 건강 대학의 연구 센터, 이 사업을 지원하기위한 생물학부를 인정하고 싶습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungal/Bacterial DNA kit	Zymo Research	D6005
HindIIIHF enzyme	New England Biolabs	R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Plasmid miniprep kit	Qiagen	12123
SacII enzyme	New England Biolabs	R0157S
Salmon sperm DNA	Thermofisher	AM9680
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S

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Genetics

사카로미세스 cerevisiae에서 연대 수명을 조절하는 유전 링크의 특성화를 위한 억제기 스크린

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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