בידוד של עכבר כליות תושב CD8+ תאי T לניתוח ציטומטריה זרימה
Summary
בעקבות זיהום ויראלי, הכליות מטפחות מספר גדול יחסית של תאי CD8+ T ומציעות הזדמנות לחקור תאי TRM שאינם ריר. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבודד לימפוציטים כליות העכבר לניתוח ציטומטריה זרימה.
Abstract
תא T זיכרון תושב רקמות (TRM)הוא תחום המתרחב במהירות של מחקר אימונולוגיה. בידוד תאי T מרקמות שונות שאינן לימפואידיות הוא אחד השלבים העיקריים לחקור TRMs. ישנן וריאציות קלות בפרוטוקולי בידוד לימפוציטים עבור איברים שונים. הכליה היא איבר חיוני שאינו לימפואידים עם חדירת תאים חיסוניים רבים במיוחד לאחר חשיפה לפתוגן או הפעלה אוטואימונית. בשנים האחרונות, מעבדות מרובות כולל שלנו החלו לאפיין תאי CD8+ T תושבי כליות במסגרות פיזיולוגיות ופתולוגיות שונות הן בעכבר והן בבני אדם. בשל שפע של לימפוציטים T, הכליה מייצגת איבר מודל אטרקטיבי ללמוד TRMs ברקמות שאינן ריר או לא מחסום. כאן, נתאר פרוטוקול נפוץ במעבדות ממוקדות TRMכדי לבודד תאי CD8+ T מכליות עכבר בעקבות זיהום ויראלי מערכתי. בקצרה, באמצעות מודל זיהום וירוס דלקת לימפוציטית חריפה (LCMV) בעכברים C57BL/6, אנו מדגימים CD8תוך וסקולרי + תיוג תא T, עיכול אנזימטי, צנטריפוגה שיפוע צפיפות לבודד ולהעשיר לימפוציטים מכליות העכבר כדי להפוך דגימות מוכנות לניתוח ציטומטריה זרימה הבאים.
Introduction
זיכרון תושב רקמות (TRM) תאי T מייצגים את אחת מאוכלוסיות תאי T הנפוצות ביותר בעכברים אנושיים ונדבקים בוגרים. תאיT RM מספקים את הקו הראשון של ההגנה החיסונית ומעורבים באופן קריטי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגייםשונים 1,2,3,4,5. בהשוואה לתאי T במחזור, תאי T RM נושאיםסמני משטח ברורים עם תוכניות שעתוקייחודיות 6,7,8. הרחבת הידע שלנו בביולוגיה של TRM היא המפתח להבנת תגובות תאי T החיוניים לפיתוח עתידי של חיסונים ואימונותרפיות מבוססי תאי T.
בנוסף סמנים מולקולריים משותפים נפוצים של TRMs על פני כל הרקמות שאינן לימפואידיות, הצטברות ראיות עולה כי תכונות ספציפיותלרקמות הם מרכיב מרכזי של ביולוגיה T RM9. הכליות מחסה תאים חיסוניים רביםכולל תאי T RM לאחר ההדבקה ומציע הזדמנותמצוינת ללמוד ביולוגיה של תאי T RM ברקמה שאינה ריר. LCMV חריפה (וירוס choriomeningitis לימפוציטית) זיהום באמצעות מסלול תוך-פרטית הוא מודל זיהום מערכתי מבוסס היטב ללמוד תגובות תאי T ספציפיים אנטיגן בעכברים. הזיהום נפתר בדרך כלל ב 7-10 ימים בעכברים מסוג בר ולהשאיר מספר רב של תאי T זיכרון ספציפי LCMV במגוון של רקמות, כוללהכליה 10. P14 TCR (קולטן תא T) עכברים מהודקים לשאת CD8+ תאי T לזהות את אחד האפיטופים הדומיננטיים במערכת החיסון של LCMV שהוצגו על ידי MHC-I (סוג I מורכב היסטו-תאימות) מולקולה H2-Db בעכברים C57BL/6. שילוב של העברה מאמצת תא P14 T מסומן באופן מולד וזיהום LCMV בעכברים, CD8+ אפקט ותאי T זיכרון נמצאים במעקב, כוללהתביור T RM והומלוסטזיס.
ברקמות מחסום מסוימות, כגון תא לימפוציטים intraepithelial מעיים (IEL) ובלוטות הרוק, הליך בידוד לימפוציטים הוקמה מניב אחוז גבוה של תאי TRM עם זיהום תאי T נשא דם מינימלי בעכבר LCMVמודל 11. עם זאת, ברקמות שאינן מחסום, כגון הכליה, רשת כלי דם צפופה מכילה מספר רב של תאים CD8+ T במחזור. זה כבר מתועד היטב כי אפילו חיסון מוצלח לא יכול להסיר ביעילות את כל תאי CD8+ T במחזור. כדי להתגבר על משוכה טכנית זו, כתמי נוגדנים תוך וסקולריים הוקמה כ אחת הטכניקות הנפוצות ביותר במעבדות TRM 12. בקצרה, 3-5 דקות לפני המתת חסד, 3 מיקרוגרם / עכבר נוגדן נגד CD8 (כדי לסמן CD8+ תאי T) מועבר דרך הווריד. קיר כלי דם שלם מונע דיפוזיה מהירה של הנוגדן בתוך פרק זמן קצר זה (כלומר, 3-5 דקות) ורק תאים תוך-וסקולריים מסומנים. בעקבות פרוטוקול בידוד לימפוציטים סטנדרטי, תאים תוך וסקולריים לעומת חוץ וסקולריים ניתן להבדיל בקלות באמצעות ציטומטריית זרימה.
כאן, נתאר פרוטוקולסטנדרטי נפוץ במעבדות T RM לביצוע תיוג תוך וסקולרי, בידוד לימפוציטים וניתוח ציטומטריה זרימה של תאי CD8+ T בכליות באמצעות עכבר C57BL/6 שקיבל CD45.1+ תאי P14 T וזיהום LCMV 30 יוםלפני 13. ניתן להשתמש באותו פרוטוקול כדי ללמוד הן את תאי T משפיעים והן זיכרון T בכליה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמו חסינות ספציפית לרקמות הוא אזור מתרחב במהירות של מחקר, הצטברות ראיות עולה כי תאים חיסוניים, במיוחד אוכלוסיית לימפוציטים ניתן לזהות כמעט בכל האיברים בעכברים אנושיים או נגועים או מחוסנים. מודל זיהום עכבר LCMV הוא מודל מבוסס היטב ללמוד תגובת תאי T ספציפיים אנטיגן, מחולל ובידול תאי T זיכרון כ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי NIH מעניק AI125701 ו AI139721, תוכנית CLIP המכון לחקר הסרטן האגודה האמריקנית לסרטן להעניק RSG-18-222-01-LIB כדי N.Z. אנו מודים לקרלה גורנה וסבסטיאן מונטנינו ממתקן Flow Cytometry. נתונים שנוצרו במתקן המשאבים המשותפים של Cytometry זרימה נתמכו על ידי המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו (UTHSCSA), NIH / NCI מענק P30 CA054174-20 (מרכז מחקר קליני ותרגום [CTRC] ב UTHSCSA), ו UL1 TR001120 (פרס מדע קליני ותרגום).
Materials
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
- Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
- Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
- Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
- Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
- Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
- Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
- Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
- Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
- Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
- Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
- Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).
