Isolatie van Mouse Kidney-Resident CD8+ T cellen voor Flow Cytometry Analysis
Summary
Na virale infectie, nier herbergt een relatief groot aantal CD8+ T cellen en biedt een kans om niet-mucosale TRM cellen te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol om muisnierlymfocyten te isoleren voor stromingscytometrieanalyse.
Abstract
Tissue-resident memory T cell (TRM)is een snel groeiend gebied van immunologie onderzoek. Het isoleren van T-cellen uit verschillende niet-lymfeweefsels is een van de belangrijkste stappen om TRMs te onderzoeken. Er zijn lichte variaties in lymfocyten isolatie protocollen voor verschillende organen. Nier is een essentieel niet-lymfoïde orgaan met tal van immuuncelinfiltratie vooral na blootstelling aan ziekteverwekkers of auto-immuunactivatie. In de afgelopen jaren zijn meerdere laboratoria, waaronder onze eigen, begonnen met het karakteriseren van nierbewoner CD8+ T-cellen in verschillende fysiologische en pathologische omgevingen in zowel muis als mens. Door de overvloed aan T-lymfocyten, nier vertegenwoordigt een aantrekkelijk model orgaan om TRMs studie in niet-mucosale of niet-barrièreweefsels. Hier zullen we een protocol beschrijven dat vaak wordt gebruikt in TRM-gerichtelaboratoria om CD8+ T-cellen te isoleren van muizennieren na systemische virale infectie. Kortom, met behulp van een acuut lymfatisch choriomeningitisvirus (LCMV) infectiemodel in C57BL/6 muizen, tonen we intravasculaire CD8+ T-cellabeling, enzymatische spijsvertering en dichtheidgradiëntcentrifugatie aan om lymfocyten te isoleren en te verrijken van muizennieren om monsters klaar te maken voor de daaropvolgende stromingscytometry-analyse.
Introduction
Weefsel-resident geheugen (TRM)T-cellen vertegenwoordigen een van de meest voorkomende T-cel populaties in volwassen menselijke en geïnfecteerde muizen. TRM cellen bieden de eerste lijn van immuunafweer en zijn kritisch betrokken bij verschillende fysiologische en pathologische processen1,2,3,4,5. Vergeleken met circulerende T-cellen, TRM cellen dragen verschillende oppervlakte markers met unieke transcriptie programma’s6,7,8. Het uitbreiden van onze kennis van TRM biologie is de sleutel tot het begrijpen van T-celreacties die essentieel is voor de toekomstige ontwikkeling van T-celgebaseerde vaccins en immunotherapieën.
Naast de algemeen gedeelde moleculaire markers van TRMs in alle niet-lymfeweefsels, accumuleren bewijs suggereren dat weefsel-specifieke kenmerken zijn een centrale component van TRM biologie9. Nier herbergt veel immuuncellen, waaronder TRM cellen na infectie en biedt een geweldige kans om TRM celbiologie te bestuderen in een niet-mucosale weefsel. Acute LCMV (lymfatische choriomeningitis virus) infectie via intraperitoneale route is een gevestigde systemische infectie model om antigeen-specifieke T-cel reacties bij muizen te bestuderen. De infectie wordt meestal opgelost in 7-10 dagen in wilde type muizen en laat een groot aantal LCMV-specifieke geheugen T cellen in een verscheidenheid van weefsels, waaronder de nier10. P14 TCR (T cel receptor) transgene muizen dragen CD8+ T cellen herkennen een van de immuun-dominante epitopen van LCMV gepresenteerd door MHC-I (klasse I grote histocompatibiliteit complex) molecuul H2-Db in C57BL/6 muizen. Het combineren van congenisch gemarkeerde P14 T-cel adoptieve overdracht en LCMV-infectie bij muizen, CD8+ effector en geheugen T-cellen worden bijgehouden, inclusief TRM-differentiatie en homeostase.
In sommige barrièreweefsels, zoals darm intraepitheliale lymfocyten (IEL) compartiment en speekselklieren, gevestigde lymfocyte isolatie procedure levert een hoog percentage van TRM cellen met minimale door bloed overgedragen T-cel besmetting in de muis LCMV model11. Echter, in niet-barrièreweefsels, zoals de nier, dicht vasculaire netwerk bevat een groot aantal circulerende CD8+ T cellen. Het is goed gedocumenteerd dat zelfs succesvolle perfusie niet efficiënt alle circulerende CD8+ T cellen kan verwijderen. Om deze technische hindernis te overwinnen, intravasculaire antilichaam kleuring is vastgesteld als een van de meest gebruikte technieken in TRM labs12. Kortom, 3-5 minuten voor euthanasie wordt 3 μg/muis anti-CD8 antilichaam (label CD8+ T cellen) intraveneus geleverd. Intacte bloedvatwand voorkomt snelle verspreiding van het antilichaam binnen deze korte periode (d.w.z. 3-5 minuten) en alleen intravasculaire cellen worden gelabeld. Volgens het standaard protocol voor lymfocytenisolatie kunnen intravasculaire versus extravasculaire cellen gemakkelijk te onderscheiden worden met behulp van stroomcytometrie.
Hier zullen we een standaardprotocol beschrijven dat vaak wordt gebruikt in TRM-laboratoria om intravasculaire etikettering, lymfocytenisolatie en stroomcytometrieanalyse van nier-CD8+ T-cellen uit te voeren met behulp van een C57BL/6-muis die 30 dagen voor13cd45.1+ P14 T-cellen en LCMV-infectie heeft ontvangen. Hetzelfde protocol kan worden gebruikt om zowel effector als geheugen T-cellen in de nier te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Als weefsel specifieke immuniteit is een snelle groeiende gebied van onderzoek, accumuleren bewijs suggereren dat immuuncellen, vooral lymfocyten populatie kan worden geïdentificeerd in bijna alle organen in volwassen menselijke of geïnfecteerde of geïmmuniseerde muizen. LCMV muis infectie model is een gevestigde model om antigeen-specifieke T-cel respons, effector en geheugen T cel differentiatie met inbegrip van TRM biologie over meerdere weefsels te bestuderen. Hier beschreven we een protocol om CD8…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidies AI125701 en AI139721, Cancer Research Institute CLIP programma en American Cancer Society subsidie RSG-18-222-01-LIB aan N.Z. Wij danken Karla Gorena en Sebastian Montagnino van Flow Cytometry Facility. Gegevens gegenereerd in de Flow Cytometry Shared Resource Facility werden ondersteund door de University of Texas Health Science Center in San Antonio (UTHSCSA), NIH / NCI subsidie P30 CA054174-20 (Clinical and Translational Research Center [CTRC] op UTHSCSA), en UL1 TR001120 (Clinical and Translational Science Award).
Materials
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
- Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
- Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
- Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
- Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
- Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
- Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
- Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
- Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
- Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
- Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
- Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).
