Hier wordt een protocol gepresenteerd voor superresolutie live-cell imaging in intact weefsel. We hebben de voorwaarden gestandaardiseerd voor beeldvorming van een zeer gevoelige volwassen stamcelpopulatie in zijn inheemse weefselomgeving. Deze techniek omvat het balanceren van temporele en ruimtelijke resolutie om de directe observatie van biologische verschijnselen in levend weefsel mogelijk te maken.
Er is al lang een cruciale afweging tussen ruimtelijke en temporele resolutie in beeldvorming. Beeldvorming buiten de diffractiegrens van licht is traditioneel beperkt tot alleen te gebruiken op vaste monsters of levende cellen buiten weefsel gelabeld met een sterk fluorescerend signaal. De huidige live celbeeldvormingstechnieken met superresolutie vereisen het gebruik van speciale fluorescentiesondes, hoge verlichting, meerdere beeldverwervingen met verwerking na acquisitie of vaak een combinatie van deze processen. Deze vereisten beperken de biologische monsters en contexten waarop deze techniek kan worden toegepast aanzienlijk.
Hier beschrijven we een methode om superresolutie (~ 140 nm XY-resolutie) time-lapse fluorescentie live celbeeldvorming in situ uit te voeren. Deze techniek is ook compatibel met een lage fluorescerende intensiteit, bijvoorbeeld EGFP of mCherry endogene tagged at lowly expressed genes. Als proof-of-principle hebben we deze methode gebruikt om meerdere subcellulaire structuren in de Drosophila testis te visualiseren. Tijdens weefselvoorbereiding worden zowel de cellulaire structuur als de weefselmorfologie gehandhaafd binnen de ontlede testis. Hier gebruiken we deze techniek om de dynamiek van microtubuli, de interacties tussen microtubuli en het kernmembraan, evenals de aanhechting van microtubuli aan centromeren in beeld te brengen.
Deze techniek vereist speciale procedures bij monstervoorbereiding, monstermontage en immobilisatie van monsters. Bovendien moeten de monsters na dissectie enkele uren worden bewaard zonder de cellulaire functie en activiteit in gevaar te brengen. Hoewel we de omstandigheden voor live superresolutiebeeldvorming specifiek in Drosophila mannelijke kiembaanstamcellen (GSC’s) en voorloperkiemcellen in ontleed testisweefsel hebben geoptimaliseerd, is deze techniek breed toepasbaar op een verscheidenheid aan verschillende celtypen. Het vermogen om cellen onder hun fysiologische omstandigheden te observeren zonder in te boeten aan ruimtelijke of temporele resolutie zal dienen als een onschatbaar hulpmiddel voor onderzoekers die cruciale vragen in de celbiologie willen beantwoorden.
Het visualiseren van subcellulaire structuren en eiwitdynamiek in levende cellen met een resolutie voorbij de diffractiegrens van licht is meestal zeer uitdagend1-3. Terwijl meerdere superresolutietechnieken zoals Stochastische-Optische-Reconstructie-Microscopie (STORM), Foto-Geactiveerde-Lokalisatie-Microscopie (PALM) en Gestimuleerde-Emissie-Uitputting (STED)4,5,6 microscopie zijn ontwikkeld, beperken complicaties in de monstervoorbereiding evenals de noodzaak om levensvatbaarheid en activiteit ex vivo te behouden, het gebruik van conventionele superresolutiemicroscopie voor het weergeven van levende monsters. Conventionele confocale microscopie kan geen ruimtelijke resolutie bereiken die verder gaat dan ~230 nm XY-resolutie en is vaak onvoldoende om ingewikkelde cellulaire substructuren5,6te observeren . Een recente ontwikkeling in confocale microscopie, Airyscan superresolutiebeeldvorming, kan echter ongeveer 140 nm (XY-resolutie)7,8 bereiken en heeft een relatief eenvoudig monstervoorbereiding dat compatibel is met live beeldvorming. Aangezien dit beelddetectiesysteem een lange acquisitietijd vereist, gaat de hoge ruimtelijke resolutie ten koste van tijdresolutie9. Daarom is een methode nodig om ervoor te zorgen dat live cell imaging wordt uitgebreid met een hoge ruimtelijke resolutie.
Hier ontwikkelden we een methode voor het observeren van levende cellen in intact weefsel met de optimale resolutie om subcellulaire structuren te ontcijferen met gedetailleerde ruimtelijke informatie. Deze methode is zo ontworpen dat monsters gedurende een lange periode (~ 10 uur) stabiel kunnen worden gemonteerd zonder te bewegen of te degenereren. De live celmedia die in deze techniek worden gebruikt, kunnen de cellulaire functie ondersteunen en fotobleaching tot 10 uur vermijden onder een microscoop met superresolutie. Ten slotte minimaliseert dit protocol de meeste spanningen veroorzaakt door de constante verlichting van lasers over langere perioden, zoals hypoxie, veranderingen in vochtigheid en temperatuur, evenals uitputting van voedingsstoffen.
Met behulp van dit protocol om Drosophila mannelijke kiembaanstamcellen (GSC’s) in beeld te brengen, konden we observeren hoe de asymmetrische activiteit van microtubuli preferentiële interactie mogelijk maakt met epigenetisch verschillende zusterchromatiden10,11,12,13. Dit soort cellulaire gebeurtenissen zijn zeer dynamisch en zijn zeer moeilijk te visualiseren in levende cellen met behulp van andere beeldvormingsmethoden met superresolutie, zoals STORM, PALM of STED. We verwachten dat deze methode zeer nuttig zal worden voor celbiologen, omdat ze de dynamische subcellulaire structuren van levende cellen in weefsels willen begrijpen. Er zijn veel gebieden waarop deze methode kan worden toegepast, zoals het bestuderen van de dynamiek van eiwitten; inzicht in de beweging van cellen; en lineage tracing en cellulaire differentiatieprocessen, naast andere mogelijke toepassingen.
Superresolutiemicroscopiemethoden bieden een ruimtelijke resolutie tot 10s nanometer4,5,6. De STORM- en PALM-microscopiemethoden maken een resolutie tot 20 tot 50 nm (XY-resolutie) mogelijk, terwijl STED-microscopie een resolutie van 20 tot 100 nm (XY-resolutie) biedt. De ruimtelijke resolutie van SIM-microscopie is beperkt tot 100 tot 130 nm15. Vanwege de hoge fotondichtheid en lange acquisitietijd is het echter uite…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen Integrated Imaging Core-faciliteit aan de Johns Hopkins University bedanken voor microscopen en software voor gegevensanalyse. We danken J. Snedeker en Q. E. Yu voor proeflezen en suggesties, en X.C. lableden voor nuttige discussies en suggesties. Ondersteund door NIGMS/NIH R35GM127075, het Howard Hughes Medical Institute, de David and Lucile Packard Foundation en Johns Hopkins University startup funds (X.C.).
Adobe Illustrator CS6 (figure making software) | Adobe | N/A | |
Dialysis membrane | Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane | Cat No. 08-67121 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | Cat. no. 26140079 | 15% (V/V) |
Fiji (analysis software) | NIH | N/A | Image fluorescence intensity quantification |
Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) | World Precision Instrument, Inc. | FD35PDL-100 | |
Imaris (image reconstruction software) | Bitplane | N/A | 3D image reconstruction |
Imerssion oil | Zeiss | Immersol 518F/30 °C | |
Insulin | Sigma | Cat. No. 15550 | 200 µg/ml |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | Cat No. – 15140-122 | 0.6x |
Schneider Drosophila media | Invitrogen | Cat No. – 11720-034 | |
Spinning disc confocal microscope | Zeiss | N/A | equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA). |
Tissue paper | Kimwipe | N/A | Wet to form humid chamber |
LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module | Zeiss | N/A | equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA) |
ZEN (imaging software) | Zeiss | N/A |