Superupplösning Live Cell Imaging av subcellulära strukturer
Summary
Presenteras här är ett protokoll för superupplösning live-cell imaging i intakt vävnad. Vi har standardiserat förutsättningarna för avbildning av en mycket känslig vuxen stamcellspopulation i sin inhemska vävnadsmiljö. Denna teknik innebär balansering av tidsmässig och rumslig upplösning för att möjliggöra direkt observation av biologiska fenomen i levande vävnad.
Abstract
Det har länge varit en avgörande kompromiss mellan rumslig och tidsmässig upplösning i bildbehandling. Avbildning utanför ljusgränsen har traditionellt begränsats till att endast användas på fasta prover eller levande celler utanför vävnaden märkt med stark fluorescerande signal. Nuvarande superupplösta livecellavbildningstekniker kräver användning av speciella fluorescenssonder, hög belysning, flera bildförvärv med bearbetning efter förvärv eller ofta en kombination av dessa processer. Dessa förutsättningar begränsar avsevärt de biologiska prover och sammanhang som denna teknik kan tillämpas på.
Här beskriver vi en metod för att utföra superupplösning (~ 140 nm XY-upplösning) time-lapse fluorescens live cell imaging in situ. Denna teknik är också kompatibel med låg fluorescerande intensitet, till exempel EGFP eller mCherry endogent märkta vid lågt uttryckta gener. Som ett principbevis har vi använt denna metod för att visualisera flera subcellulära strukturer i Drosophila testikel. Under vävnadspreparat upprätthålls både cellstrukturen och vävnadsmorfologin inom den dissekerade testiken. Här använder vi denna teknik för att avbilda mikrotubuledynamik, interaktionerna mellan mikrotubuler och kärnmembranet, liksom fastsättning av mikrotubuli till centromerer.
Denna teknik kräver speciella procedurer vid provberedning, provmontering och immobilisering av prover. Dessutom måste proverna underhållas i flera timmar efter dissekering utan att kompromissa med cellulär funktion och aktivitet. Medan vi har optimerat förutsättningarna för levande superupplösningsavbildning specifikt i Drosophila manliga könsceller (GSCs) och stamceller i dissekerad testikelvävnad, är denna teknik i stort sett tillämplig på en mängd olika celltyper. Förmågan att observera celler under deras fysiologiska förhållanden utan att offra vare sig rumslig eller temporal upplösning kommer att fungera som ett ovärderligt verktyg för forskare som försöker ta itu med viktiga frågor inom cellbiologi.
Introduction
Visualisera subcellulära strukturer och proteindynamik i levande celler med upplösning utöver ljusets diffraktionsgräns är vanligtvis mycketutmanande 1-3. Medan flera superupplösningstekniker som Stochastic-Optical-Reconstruction-Microscopy (STORM), Photo-Activated-Localization-Microscopy (PALM) och Stimulated-Emission-Depletion (STED)4,5,6 mikroskopi har utvecklats, komplikationer i provberedning samt behovet av att upprätthålla livskraft och aktivitet ex vivo, begränsa användningen av konventionella superupplösning mikroskopi för bildbehandling levande prover. Konventionell konfokal mikroskopi kan inte nå rumslig upplösning bortom ~ 230 nm XY-upplösning och är ofta otillräcklig för att observera invecklade celluläraunderstrukturer 5,6. En ny utveckling inom konfokal mikroskopi, Airyscan superupplösningsavbildning, kan dock uppnå cirka 140 nm (XY-upplösning)7,8 ochhar en relativt enkel provberedning som är kompatibel med levande avbildning. Eftersom detta bildbehandlingsdetekteringssystem kräver en lång förvärvstid, kommer dess höga rumsliga upplösning till priset av temporal upplösning9. Därför behövs en metod för att säkerställa att levande cellavbildning utökas med hög rumslig upplösning.
Här utvecklade vi en metod för att observera levande celler i intakt vävnad med optimal upplösning för att dechiffrera subcellulära strukturer med detaljerad rumslig information. Denna metod är utformad som sådan så att prover kan monteras stabilt under en längre tid (~ 10 h) utan att flytta eller degenerera. Livecellmedierna som används i denna teknik kan stödja cellulär funktion och undvika fotoblekning i upp till 10 timmar under ett superupplöst mikroskop. Slutligen minimerar detta protokoll de flesta påfrestningar som orsakas av konstant belysning av lasrar under längre tidsperioder som hypoxi, förändringar i fuktighet och temperatur samt näringsutmattning.
Med hjälp av detta protokoll för att avbilda Drosophila manliga könsceller (GSCs), kunde vi observera hur mikrotubulernas asymmetriska aktivitet möjliggör förmånlig interaktion med epigenetiskt distinkta systerkromatider10,11,12,13. Dessa typer av cellulära händelser är mycket dynamiska och är mycket svåra att visualisera i levande celler med andra superupplösningsavbildningsmetoder som STORM, PALM eller STED. Vi förväntar oss att denna metod kommer att bli mycket användbar för cellbiologer eftersom de syftar till att förstå de dynamiska subcellulära strukturerna hos levande celler som bor i vävnader. Det finns många områden där denna metod kan tillämpas på, till exempel att studera proteinernas dynamik; förstå cellernas rörelse; och härstamningsspårning och cellulära differentieringsprocesser, bland andra möjliga applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Superupplösta mikroskopimetoder ger rumslig upplösning så hög som 10s nanometer4,5,6. Storm- och PALM-mikroskopimetoderna möjliggör upplösning upp till 20 till 50 nm (XY-upplösning), medan STED-mikroskopi ger upplösning på 20 till 100 nm (XY-upplösning). Sim-mikroskopin har en rumslig upplösning på 100 till 130 nm15. Men på grund av dess höga fotontäthet och långa förvärvstid är det extremt utmanan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Integrated Imaging Core-anläggningen vid Johns Hopkins University för mikroskop och dataanalysprogramvara. Vi tackar J. Snedeker och Q. E. Yu för korrekturläsning och förslag, och X.C. labbmedlemmar för hjälpsamma diskussioner och förslag. Stöds av NIGMS / NIH R35GM127075, Howard Hughes Medical Institute, David och Lucile Packard Foundation och Johns Hopkins University startup fonder (X.C.).
Materials
| Adobe Illustrator CS6 (figure making software) | Adobe | N/A | |
| Dialysis membrane | Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane | Cat No. 08-67121 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | Cat. no. 26140079 | 15% (V/V) |
| Fiji (analysis software) | NIH | N/A | Image fluorescence intensity quantification |
| Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) | World Precision Instrument, Inc. | FD35PDL-100 | |
| Imaris (image reconstruction software) | Bitplane | N/A | 3D image reconstruction |
| Imerssion oil | Zeiss | Immersol 518F/30 °C | |
| Insulin | Sigma | Cat. No. 15550 | 200 µg/ml |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | Cat No. – 15140-122 | 0.6x |
| Schneider Drosophila media | Invitrogen | Cat No. – 11720-034 | |
| Spinning disc confocal microscope | Zeiss | N/A | equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA). |
| Tissue paper | Kimwipe | N/A | Wet to form humid chamber |
| LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module | Zeiss | N/A | equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA) |
| ZEN (imaging software) | Zeiss | N/A |
References
- Breedijk, R. M. P., et al. A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores. Scientific Reports. 10 (1), 5312 (2020).
- Maddox, P. S., et al. Imaging the mitotic spindle. Methods in Enzymology. 505, 81-103 (2012).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143 (2013).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).
- Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Huff, J., et al. The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan. Nature Methods. 14 (12), 1223 (2017).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging. Photonics. 4 (4), 41 (2017).
- Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells. Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).
- Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).
- Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells. Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).
- Wooten, M., et al. Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
