鼠标心脏中毛细血管、动脉和腹膜的动态测量和成像

Summary

这里介绍的是一个协议，通过前体监测维持压力的动脉灌注压力和流量，以及血管树成分，包括毛细管床和腹膜，研究活体murine心脏组织中的冠状微循环，因为隔膜动脉是可控和加压的。

Abstract

冠状动脉色调以及毛细血管的开启或关闭在很大程度上决定了在不断的输液压力向心肌细胞的血液。然而，很难监测整个心脏冠状动脉和毛细血管的动态变化，这主要是由于它的运动和不停的跳动。在这里，我们描述了一种方法，使监测动脉输液率，压力和直径变化的动脉和毛细血管在小鼠右心室肌肉。鼠标隔膜动脉在恒定的流量或压力下与另一个动态测量一起凝结和灌注。在用荧光标记的叶酸（例如， Alexa Fluor – 488 或 – 633 标记为小麦 – 格姆阿胶素， WGA ））进行注水后，右心室肌和隔膜中的动脉和毛细血管（和其他血管）很容易成像。然后，在存在或没有心脏收缩的情况下，可以测量容器直径的变化。当基因编码的荧光蛋白表达时，可以监测特定特征。例如，在表达NG2-DsRed的鼠标心脏中可视化了心率。该方法为研究毛细毛虫在心脏的生理功能提供了有益的平台。它还适用于通过同时测量血管/毛细管直径和动脉发光压力来研究试剂对心脏血流量的影响。这种准备，结合最先进的光学成像系统，使人们能够研究血液流动及其控制在细胞和分子水平的心脏在近生理条件下。

Introduction

适当的冠状动脉压力流量调节可保证心脏有足够的血液供应，以满足其代谢需求^1.然而，尽管过去几十年在体内和体外进行了广泛的研究，但最近才清楚冠状动脉压力流在心脏中是如何动态调节的。原因之一是由于心脏的不断跳动，难以为此类研究建立生理工作模式。无论如何，已经建立了各种方法来观察活组织或动物的冠状微血管，但这些方法都未能达到恒定/稳定的焦点和测量压力，流量和微血管直径在同一时间^2，3。10年前，在跳动的心脏中引入了冠状动脉微血管的直接可视^化，但小血管的直径测量具有挑战性，许多与微循环相关的专门细胞类型的特定功能同样令人烦恼。即使是频闪法和浮动目标系统也不能同时提供上述^信息。然而，使用上述技术已获得大量有价值的资料，这有助于我们更深入地了解冠状动脉血流的调节^。本文描述的方法将帮助人们详细研究和理解冠状动脉、动脉和微血管的成分对刺激和代谢需求的反应。

我们为开展这些研究而建立的工作模式是建立在韦斯特霍夫等人先前的工作基础上^的。在小鼠心脏的隔膜动脉凝固后，生理盐水溶液用于渗透动脉，以保持肌细胞和心脏组织的其他成分滋养。使用适当的荧光指示器监测动脉注水压力、流量和血管直径等生理功能。该方法使我们能够在活组织生理压力下可视化冠状微血管床，并首次研究微循环调节背后的细胞机制。

Protocol

所有动物护理均符合马里兰大学巴尔的摩分校的指导方针和机构动物护理和使用委员会批准的协议。 1. 制定解决方案 注意：提前准备解决方案。实验中使用了两种基本溶液：（1） 用于沐浴超富的生理盐水溶液 （PSS）和 （2） 泰罗德用于流明香水的溶液。需要用 CO2 连续冒泡才能保持 PSS 的 pH。HEPES 缓冲的 Tyrode 溶液用于流明而不是 PSS，以避免气?…

Representative Results

当荧光血管标记在血管流明中灌注时（这里 WGA 与 Alexa Fluor-488 结合），就可以使用高速共生显微镜可视化 图 5（ 左面板）中显示的整个血管树。进一步的放大使毛细的成像细节（图5，右面板）。由于加压系统支持对发光压力的持续监测，这种制剂可用于将动脉直径的变化与动脉压力关联使用。 视频 1 显示，当从流明中送达对 ATP 敏感的<s…

Discussion

在目前的工作中，我们引入了一种非常简单但非常实用的外生体方法，以研究生理条件下心脏的冠状微循环。这种方法是从机械调查修改使用大鼠^2。具有挑战性的新增技术是高速和高光学分辨率的成像技术。因此，我们能够利用目前市售的先进光学成像系统。通过仔细解剖和放置功能肌肉准备在有利的位置，我们能够可视化动脉，毛细血管前动脉，毛细血管，以及腹膜，并能够…

Materials

1 M CaCl2 solution	MilliporeSigma, USA	21115
1 M MgCl2 solution	MilliporeSigma, USA	M1028
AxoScope software	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Chiller/water incubator	FisherScientific, USA	Isotemp 3016S
Confocal	Nikon Instruments, USA	A1R
Custom glass tubing	Drummond Scientific Company	9-000-3301
Digidata 1322A	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Dissecting microscope	Olympus, Japan	SZX12
Endothelin-1	MilliporeSigma, USA	E7764
Forceps	Fine Scientific Tools	11295-51
Heparin Sodium Salt	Sigma-Aldrich, USA	H3393
Inline solution Heater	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	SH-27B
Isoflurane	VETone, Idaho, USA	502017
Micropipette puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97
Micropipette/cannula holder	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	64-0981
NG2DsRedBAC transgenic mouse	The Jackson Laboratory	#008241
Nylon thread for tying blood vessels	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	THR-G
PDMS (polydimethylsiloxane)	SYLGARD, Germantown, WI, USA	184 SIL ELAST KIT
Peristaltic pump	Gilson, Middleton, WI, USA	minipuls 3
Pressure Servo Controller	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-S
Scissors	Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA	15000-10
Servo Pump	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-P
Temperature controller	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA	W11261