Dynamisk måling og avbildning av kapillærer, arterioler og pericytter i musehjerte
Summary
Presentert her er en protokoll for å studere koronar mikrosirkulasjon i levende murine hjertevev ved ex vivo overvåking av arteriell perfusjon trykk og flyt som opprettholder trykket, samt vaskulære trekomponenter inkludert kapillære senger og pericytter, som septal arterien er hermetisert og trykksatt.
Abstract
Koronar arteriell tone sammen med åpningen eller lukking av kapillærene bestemmer i stor grad blodstrømmen til kardiomyocytter ved konstant perfusjonstrykk. Det er imidlertid vanskelig å overvåke de dynamiske endringene i koronararteriolene og kapillærene i hele hjertet, først og fremst på grunn av bevegelsen og non-stop juling. Her beskriver vi en metode som muliggjør overvåking av arteriell perfusjonshastighet, trykk og diameterendringer av arteriolene og kapillærer i musen høyre ventrikulære papillære muskler. Musen septal arterien er cannulated og perfused ved en konstant strømning eller trykk med den andre dynamisk målt. Etter perfusjon med fluorescerende merket lectin (f.eks Alexa Fluor-488 eller -633 merket Wheat-Germ Agglutinin, WGA), kan arteriolene og kapillærerne (og andre fartøy) i høyre ventrikkelpapilpionasje og septum lett avbildes. Endringene i kardiameteren kan deretter måles i nærvær eller fravær av hjertesammentrekninger. Når genetisk kodede fluorescerende proteiner ble uttrykt, bestemte funksjoner kan overvåkes. For eksempler ble pericytter visualisert i musehjerter som uttrykte NG2-DsRed. Denne metoden har gitt en nyttig plattform for å studere de fysiologiske funksjonene til kapillære pericytter i hjertet. Det er også egnet for å studere effekten av reagenser på blodstrømmen i hjertet ved å måle den vaskulære / kapillære diameteren og arteriell luminaltrykk samtidig. Dette preparatet, kombinert med et toppmoderne optisk bildebehandlingssystem, gjør det mulig å studere blodstrømmen og dens kontroll på cellulært og molekylært nivå i hjertet under nesten fysiologiske forhold.
Introduction
Passende koronar trykkstrømregulering sikrer tilstrekkelig blodtilførsel til hjertet for å møte sine metabolske krav1. Det har imidlertid bare nylig blitt klart hvordan koronar trykkstrøm er dynamisk regulert i hjertet, til tross for omfattende studier som har blitt utført in vivo og in vitro de siste tiårene. En av årsakene er vanskeligheten med å etablere en fysiologisk arbeidsmodell for slike studier på grunn av konstant juling av hjertet. Uansett er det etablert en rekke metoder for observasjon av koronarmikrokarene i levende vev eller dyr, men ingen av disse metodene var i stand til å oppnå konstant / stabilt fokus og målinger av trykk, strømning og mikrovaskulær diameter samtidig2,3. Den direkte visualiseringen av koronar arterielle mikrokar i bankende hjerte ble introdusertfor flere tiår siden 4,3, men diametermålingene i små fartøy var utfordrende og de spesifikke funksjonene til de mange spesialiserte celletypene forbundet med mikrosirkulasjonen var like vexing. Selv den stroboskopiske metoden og det flytende objektive systemet kunne ikke gi ovennevnte informasjon samtidig5. Likevel er det oppnådd en betydelig mengde verdifull informasjon ved hjelp av de nevnte teknologiene, noe som har hjulpet oss med å forstå mer om reguleringen av koronarblodstrøm 6. Metoden vi beskriver i dette papiret vil hjelpe en undersøke og forstå i detalj hvordan komponenter av koronararterier, arteriolene og mikrovaskulaturen reagerer annerledes på stimuleringer og metabolske krav.
Arbeidsmodellen vi etablerte for å forfølge disse studiene ble bygget på det tidligere arbeidet til Westerhof et al.2. Etter kanylering av septalarterien i musehjertet, ble fysiologisk saltløsning brukt til å perfuse den arterien for å holde myocytter og andre komponenter i hjertevevet næret. Det arterielle perfusjonstrykket, strømmen og den vaskulære diameteren ble overvåket blant andre fysiologiske funksjoner ved hjelp av passende fluorescerende indikatorer. Denne metoden gjør det mulig for oss å visualisere den koronarkrovaskulære sengen under fysiologisk trykk i levende vev og studere cellulære mekanismer underliggende mikrosirkulasjonsregulering for første gang.
Protocol
Representative Results
Discussion
I det nåværende arbeidet har vi introdusert en bemerkelsesverdig enkel, men svært praktisk ex vivo-metode for å studere koronar mikrosirkulasjon i hjertet under fysiologiske forhold. Denne metoden ble endret fra mekaniske undersøkelser ved hjelp av rotter2. Det utfordrende tillegget var bildeteknologien med høy hastighet og høy optisk oppløsning. Vi var derfor i stand til å dra nytte av de avanserte optiske bildesystemene som nå er kommersielt tilgjengelige. Ved forsiktig disseksjon og p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av Center for Biomedical Engineering and Technology (BioMET); NIH (1U01HL116321) og (1R01HL142290) og American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).
Materials
| 1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
References
- Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
- Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart. Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).
- Tillmanns, H., et al. Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle. Circulation Research. 34, 561-569 (1974).
- Martini, J., Honig, C. R. Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply. Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).
- Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques. Circulation Research. 49, 342-353 (1981).
- Marcus, M. L., et al. Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level. Circulation. 82, 1-7 (1990).
- Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation. Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).
- Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries. Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).
- Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).
- Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion. Circulation. 89, 2412-2420 (1994).
- Lawton, P. F., et al. a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology. Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).
