Dynamisk mätning och avbildning av kapillärer, arterioler och pericyter i mushjärtat
Summary
Presenteras här är ett protokoll för att studera födans mikrocirkulation i levande murin hjärtvävnad genom ex vivo övervakning av kranskärlens perfusion tryck och flöde som upprätthåller trycket, liksom vaskulär träd komponenter inklusive kapillär sängar och pericytes, som septal gatan är kanylerad och trycksatt.
Abstract
Kranskärlens artärton tillsammans med öppnandet eller stängningen av kapillärerna bestämmer till stor del blodflödet till kardiomyocyter vid konstant perfusionstryck. Det är dock svårt att övervaka de dynamiska förändringarna i kranskärlen och kapillärerna i hela hjärtat, främst på grund av dess rörelse och non-stop slå. Här beskriver vi en metod som möjliggör övervakning av kranskärlens perfusionshastighet, tryck och diameter förändringar av artärer och kapillärer i mus rätt Ventrikulärt papillary muskler. Musens septala artär är kannulerad och perfused vid ett konstant flöde eller tryck med den andra dynamiskt uppmätta. Efter perfusion med en fluorescerande märkt lectin (t.ex. Alexa Fluor-488 eller -633 märkt Wheat-Germ Agglutinin, WGA), arterioler och kapillärer (och andra kärl) i rätt ventrikel papillary muskel och septum kunde lätt avbildas. Förändringar i kärldiametern kan sedan mätas i närvaro eller frånvaro av hjärtkontraktioner. När genetiskt kodade fluorescerande proteiner uttrycktes kunde specifika egenskaper övervakas. Till exempel visualiserades pericyter i mushjärtan som uttryckte NG2-DsRed. Denna metod har gett en användbar plattform för att studera de fysiologiska funktionerna hos kapillärpericyter i hjärtat. Det är också lämpligt för att studera effekten av reagenser på blodflödet i hjärtat genom att mäta kärl/kapillärdiametern och det arteriella luminaltrycket samtidigt. Denna förberedelse, i kombination med ett toppmodernt optiskt bildsystem, gör det möjligt att studera blodflödet och dess kontroll på cellulär och molekylär nivå i hjärtat under nästan fysiologiska förhållanden.
Introduction
Lämplig reglering av kranskärlstrycket säkerställer tillräcklig blodtillförsel till hjärtat för att uppfylla dess metaboliska krav1. Det har dock först nyligen blivit tydligt hur kranskärlstryckets flöde regleras dynamiskt i hjärtat, trots omfattande studier som har utförts in vivo och in vitro under de senaste decennierna. En av anledningarna är svårigheten att etablera en fysiologisk arbetsmodell för sådana studier på grund av hjärtats ständiga slag. Oavsett har en mängd olika metoder fastställts för observation av kranskärlen i levande vävnader eller djur, men ingen av dessa metoder kunde uppnå konstant / stabilt fokus och mätningarna av tryck, flöde och mikrovaskulär diameter samtidigt2,3. Den direkta visualiseringen av kranskärlens kranskärlens mikrokärl i bultande hjärta introduceradesför årtionden sedan 4,3, men diametermätningarna i små kärl var utmanande och de specifika funktionerna hos de många specialiserade celltyperna i samband med mikrocirkulationen var lika irriterande. Inte ens den stroboskopiska metoden och det flytande objektiva systemet kunde samtidigt lämna ovanstående information5. Ändå har en betydande mängd värdefull information erhållits med hjälp av ovannämnda teknik, vilket har hjälpt oss att förstå mer om regleringen av kranskärlens blodflöde6. Metoden vi beskriver i detta dokument kommer att hjälpa en att undersöka och förstå i detalj hur komponenter i kranskärlen, artärerna och mikrovaskulaturen reagerar olika på stimuleringar och metaboliska krav.
Den arbetsmodell som vi upprättade för att genomföra dessa studier byggde på det tidigare arbetet i Westerhofm.fl. Efter cannulation av septal gatan i mus hjärtat, fysiologiska saltlösning användes för att granska den gatan för att hålla myocyter och andra komponenter i hjärtvävnad näring. Kranskärlens perfusion tryck, flödet och vaskulär diameter övervakades bland andra fysiologiska funktioner med hjälp av lämpliga fluorescerande indikatorer. Denna metod gör det möjligt för oss att visualisera kranskärlsbädden under fysiologiskt tryck i levande vävnad och studera de cellulära mekanismerna bakom mikrocirkulationsreglering för första gången.
Protocol
Representative Results
Discussion
I det nuvarande arbetet har vi introducerat en anmärkningsvärt enkel men ändå mycket praktisk ex vivo-metod för att studera kranskärlsmikrocirkulationen i hjärtat under fysiologiska förhållanden. Denna metod modifierades från mekaniska undersökningar med råttor2. Det utmanande tillskottet var bildtekniken med hög hastighet och hög optisk upplösning. Vi kunde därför dra nytta av de avancerade optiska bildsystem som nu är kommersiellt tillgängliga. Genom noggrann dissekering och p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av Center for Biomedical Engineering and Technology (BioMET); NIH (1U01HL116321) och (1R01HL142290) och American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).
Materials
| 1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
References
- Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
- Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart. Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).
- Tillmanns, H., et al. Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle. Circulation Research. 34, 561-569 (1974).
- Martini, J., Honig, C. R. Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply. Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).
- Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques. Circulation Research. 49, 342-353 (1981).
- Marcus, M. L., et al. Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level. Circulation. 82, 1-7 (1990).
- Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation. Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).
- Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries. Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).
- Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).
- Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion. Circulation. 89, 2412-2420 (1994).
- Lawton, P. F., et al. a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology. Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).
