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Immunology and Infection

혈청형 1 Streptococcus pneumoniae 균주 519/43에서 돌연변이 구성

Published: September 11, 2020
doi:
10.3791/61594
, , , ,
1Faculty of Infections and Tropical Diseases, Department of Infection Biology,London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2Division of Medicine,University College London, 3Division of Infection and Immunity,University College London UCL

Summary

여기에서 우리는 DNA와 자살 플라스미드를 자연적으로 획득하는 능력을 사용하여 유전자 변형될 수 있는 S. pneumoniae 혈청형 1 균주 519/43에 대해 설명합니다. 원리의 증거로서, pneumolysin (ply) 유전자의 동종 돌연변이가 만들어졌다.

Abstract

Streptococcus pneumoniae 혈청형 1은 저소득 및 중간 소득 국가, 특히 사하라 사막 이남 아프리카에서 여전히 큰 문제로 남아 있습니다. 그 중요성에도 불구하고, 이 혈청형에 대한 연구는 그것을 변형시키는 유전적 도구의 부족으로 인해 방해를 받았습니다. 이 연구에서 우리는 혈청형 1 임상 분리주(균주 519/43)를 유전적으로 변형시키는 방법을 설명합니다. 흥미롭게도 이것은 자연적으로 DNA를 획득하는 폐렴 구균의 능력을 이용하여 달성되었습니다. 그러나 대부분의 폐렴 구균과 달리 선형 DNA의 사용은 성공적이지 못했습니다. 이 중요한 균주를 돌연변이시키기 위해서는 자살 플라스미드를 사용해야 했습니다. 이 방법론은 생물학과 병원성 측면에서 이 파악하기 어려운 혈청형을 더 깊이 이해할 수 있는 수단을 제공했습니다. 이 방법을 검증하기 위해 알려진 주요 폐렴구균 독소인 뉴몰리신은 잘 알려져 있고 따르기 쉬운 표현형을 가지고 있기 때문에 돌연변이되었습니다. 우리는 예상대로 돌연변이가 적혈구를 용해시키는 능력을 상실했음을 보여주었습니다. 관심 혈청형에서 중요한 유전자를 돌연변이시킬 수 있게 됨으로써, 우리는 복강내 및 비강내 감염 시 기능 상실 돌연변이에 대해 다른 혈청형에 대해 관찰된 표현형과 다른 표현형을 관찰할 수 있었습니다. 요약하면, 이 연구는 균주 519/43(혈청형 1)이 유전자 변형될 수 있음을 증명합니다.

Introduction

폐렴 연쇄상 구균 (S. pneumoniae, 폐렴 구균)은 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인 중 하나입니다. 최근까지 100개에 가까운 S. pneumoniae의 혈청형이 발견되었다 1,2,3,4,5,6,7. 매년 침습성 폐렴구균성 질환(IPD)으로 인해 약 700,000명이 사망하고 5세 미만 어린이가사망한다 8. S. pneumoniae는 전 세계적으로 세균성 폐렴, 중이염, 수막염 및 패혈증의 주요 원인이다9.

아프리카 수막염 벨트에서 혈청형 1은 수막염 발병의 원인이 되며, 여기서 매우 독성이 강한 서열형인 서열형(ST) ST217이 우세합니다 10,11,12,13,14,15. 수막염 병리학에서의 중요성은 아프리카 수막염 벨트의 Neisseria meningitidis의 중요성에 비유되었습니다16. 혈청형 1은 종종 IPD의 주요 원인입니다. 그러나 마차에서는 거의 발견되지 않습니다. 사실, 감비아에서는 이 혈청형이 모든 침습성 질환의 20%를 차지하지만 건강한 보균자의 0.5%에서만 발견되었습니다14,17,18,19. 유능한 폐렴구균에서의 유전자 교환 및 재조합은 일반적으로 침습성 질환보다는 보균에서 발생한다20. 또한, 혈청형 1은 폐렴구균 중에서 가장 짧은 보균률(단 9일) 중 하나인 것으로 나타났습니다. 그러므로, 이 혈청형은 다른 혈청형보다 훨씬 낮은 재조합률을 가질 수 있다고 제안되었다21.

혈청형 1 균주의 낮은 운반률의 이유와 사하라 사막 이남 아프리카의 침습성 질병에서의 중요성을 이해하기 위해서는 심층 연구가 필요합니다.

여기에서 우리는 특정 혈청형 1 균주, 519/43의 게놈 전체 돌연변이 유발을 허용하는 프로토콜을 보고합니다. 이 균주는 새로운 DNA를 쉽게 획득하여 게놈으로 재결합할 수 있습니다. 이 방법은 아직 변형되지 않았지만 519/43 배경에서 수행될 때 매우 효율적입니다(다른 표적은 돌연변이가 발생했으며 원고는 준비 중입니다). 단순히 519/43 균주를 사용하고 그 타고난 능력을 활용하고 외인성 DNA가 제공되는 방식을 대체함으로써 우리는 이 혈청형 1 균주에서 뉴몰리신 유전자(ply)를 돌연변이시킬 수 있었습니다. 이 방법은 Harvey et al.22 가 제시한 방법에 대한 개선을 나타내며, 다른 혈청형을 통해 DNA를 통과시킬 필요 없이 한 단계로 수행됩니다. 그럼에도 불구하고, 균주 간 가변성으로 인해, 모든 균주에 대해 표준화된 방법은 없다. 특정 유전자를 돌연변이시키고 그 효과를 관찰하는 능력은 혈청형 1 S. pneumoniae 균주에 대한 심오한 이해를 가능하게 할 것이며 사하라 사막 이남 아프리카의 수막염에서 이러한 균주의 역할에 대한 답을 제공할 것입니다.

Protocol

1. SOE-PCR23 에 의한 돌연변이 앰플리콘의 생성 및 스펙티노마이신 카세트의 증폭 균주 519/43에서 플라이 유전자의 측면 영역의 상동성 팔(각각 ply 5′(488bp) 및 ply3′(715bp))의 증폭을 위해 PCR을 수행하는 것으로 시작합니다. 프라이머 plyFw1_NOTI(TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5’R1_BamHI(CGAAATATAGACCAAAGGACGCGGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3’F1_BamHI(TCAAGGTCAAGTTTGGTTCT GGATCCCCTTTGGTCTATATT…

Representative Results

여기에 설명된 프로토콜은 PCR을 사용하여 왼쪽 및 오른쪽 상동성 아암을 증폭하는 동시에 플라이 유전자의 중간 영역에서 191bp를 삭제하는 것으로 시작합니다. PCR을 수행하는 동안 BamHI 부위는 왼쪽 상동성 암의 3’와 오른쪽 상동성 암의 5′ 말단에 도입됩니다(그림 1A). 그 다음에는 왼쪽 및 오른쪽 상동성 암이 하나의 앰플리콘으로 융합되는 PCR-SOE가 이어집니다(<strong cl…

Discussion

폐렴 연쇄상 구균, 특히 혈청형 1은 침습성 폐렴구균 질환 및 수막염을 유발하는 세계적인 위협이 되고 있습니다. 혈청형 1을 예방해야 하는 다양한 백신이 도입되었음에도 불구하고, 아프리카에서는 이 혈청형이 여전히 높은 이환율과 사망률을 초래하는 발병을 일으킬 수 있다13. 이 혈청형을 유전적으로 조작하는 능력은 임상적 관련성 때문에 매우 중요합니다. 이 연구?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업에 자금을 제공 한 수막염 신탁과 MRC에 감사드립니다.

Materials

AccuPrime Pfx DNA polymerase Invitrogen 12344024 Used for amplification of the fragments
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518 Used for bacterial selection on stage 1(pSD1)
Blood Agar Base Oxoid CM0055 Used to plate S. pneumoniae transformants
Bovine Serum Albumine sigma 55470 used for S. pneumoniae Transformation
Brain Heart Infusion Oxoid CM1135 used to grow S. pneumoniae cells
Calcium Chloride Cacl2 Sigma 449709 used for S. pneumoniae Transformation
Competence stimulating peptide 1 AnaSpec AS-63779 used for S. pneumoniae Transformation
Luria Broth Agar Gibco 22700025 used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Luria Broth Base (Miller's formulation) Gibco 12795027 used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Monarch Gel Extraction Kit NEB T1020S Used to extract the bands from the DNA gel
Monarch Plasmid Miniprep Kit NEB T1010S Used to extract plasmid from the cells
pGEM T-easy Promega A1360 used as suicide plasmid
S.O.C. Invitrogen 15544034 used for recovery of cells after transformation
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma S0899 used for S.pneumoniae Transformation
Spectinomycin Hydrochloride SigmaAldrich PHR1426 Used for bacterial selection
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Invitrogen 18265017 used for the creation of pSD1 and pSD2
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References

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Keywords: Serotype 1 Streptococcus PneumoniaeGenetic ModificationPlasmid ConstructionPSD1PSD2Spectinomycin CassetteRestriction DigestionLigationE. Coli TransformationS. Pneumoniae Culture
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Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43. J. Vis. Exp. (163), e61594, doi:10.3791/61594 (2020).
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