ゼ ノプス・ラエビス 胚から分離された深い外胚細胞から粘膜上皮オルガノイドを開発するための簡単なプロトコルについて述べている。多能性前駆物質は上皮性ゴブレット細胞前駆体を再生し、オルガノイドの表面上の細胞転移の開始および進行のライブ追跡を可能にする。
粘膜上皮は、粘液産生および繊毛介在性クリアランスの作用を通じて異物を除去することにより、第一の防御線を提供する。粘膜上皮の多くの臨床的に関連する欠陥は、体内の深部で起こると推測される。ここでは、 ゼノプス・ラエビス 胚から微小外科的に単離された多能性前駆物質から生成された粘液性上皮の難解な3Dモデルを紹介する。粘液性上皮器官は、深い外因性細胞から新たに生成された上皮で覆われ、後に24時間以内に固有の表皮と区別できない明確なパターン多色細胞、分泌細胞、粘液産生ゴブレット細胞で飾られている。オルガノイドの頭蓋表面に出現する間葉から上皮への動的細胞転移の完全な配列は、高解像度のライブイメージングによって追跡することができる。これらのインビトロ培養、自己組織化粘液性上皮オルガノイドは、生成、定義された培養条件、数とサイズの制御、および分化上皮の再生中の生画像への直接アクセスを有する粘液性上皮の生物学を研究する際に明確な利点を提供する。
粘膜上皮の損傷、感染、および疾患は、慢性閉塞性肺疾患、喘息、嚢胞性線維症、気管支拡張症、および原発毛様体異胞体ジスキネジー1、2、3、4などの肺障害にしばしば見られる粘液の産生およびクリアランスの障害と関連している。オルガノイド技術の最近の進歩は、例えば、粘液性上皮の再生を再現する気管圏と呼ばれる基底細胞由来の肺オルガノイドが、治療上電位1、5、6を有する有望なモデルとして生じる。しかし、その使用は、定義された培養条件の欠如とオルガノイド産生における低効率の一部で、現在限られている。ヒト気道およびカエル表皮における粘膜上皮は、組織形態、細胞組成、及びその機能7、8、9、10、11、12において著しく類似している。両生物とも、粘膜上皮は粘液と抗菌物質を分泌して第一線の防御を提供し、繊毛の同期作用を通じて有害な粒子および病原体を取り除く。
ここでは、ゼノプス・ラエビス胚13,14の多能性前駆体を用いて粘膜上皮オルガノイドを生成する簡単なプロトコルについて説明する。以前は、外因性増殖因子と細胞外マトリックスがない場合、初期の胃圏期外皮から微小単離された深部細胞が自発的に凝集体に集まり、その表面上の上皮を再生し、24時間以内に多分化および他の補助細胞を介して粘膜上皮に成熟することを報告した。急速な発展に加えて、このプロトコルは、多能性の深い外胚細胞の上皮性ゴブレット細胞前駆細胞への移行に直接アクセスする明確な機会を提供し、無傷の胚および外胚(動物キャップとも呼ばれる)からは利用できない破壊された上皮14の再生ステップを再現する。生成されるオルガノイドの数と大きさは、ゼノプス胚からの出発物質を制御することによって高効率でスケーラブルである。浮遊培養中のオルガノイドは、高解像画像、機械的検査、薬物治療、および遺伝的特徴付け14を含むさらなる分析のために、所望の段階で容易に選別および伝達することができる。この胚細胞の表面上の上皮の自発的な組織力学主導の再生は、粘膜上皮組織性オルガノイドをもたらし、粘膜上皮の生物学を研究するための新しい3次元(3D)モデルを提供する。
X.ラエビス胚の深部外胚細胞から生成された粘膜上皮オルガノイドは、体外における多能性前駆物質の上皮化および分化を研究するための強力なツールである。インビトロ臓器新生13および粘膜上皮15、17、22の開発に使用される広く採用されている動物キャップアッセイ16とは対照的に、このプロトコルで提示された深い外発性オルガノイドは、表面上皮14の組織組織駆動再生段階を監視する明確な機会を提供する。約2hpaで、新たに生成されたZO-1陽性上皮細胞(図2)は、オルガノイドの有端表面に現れ始め、組織が固まるか、またはコンプライアンスを低下させるとオルガノイド全体を覆うように集団を増加させる。粘液産生ゴブレット細胞の上皮の再生とその後の系統指定は、1日以内に化学的に定義された培養培地で自発的に進行する。これらの急速に発達する粘膜上皮オルガノイドは、上皮再生の進行段階で、動的細胞の挙動をリアルタイムで、高解像度で調べるプラットフォームを提供する。また、粘液性上皮の発達、恒常性、および関連疾患2、9、23の間に生じる根本的な疑問の調査を可能にする。特に、オルガノイド14で同定された上皮性ゴブレット細胞前駆体への移行中の深部前駆細胞の機械的感受性は、粘液分泌性のゴブレット細胞が過剰または過産である異常な基底分化に関連する呼吸器疾患をリンクさせるのに役立つ可能性がある23。
このプロトコルは、これらのオルガノイドを生成するための簡単なアプローチを提供していますが、実験で成功するためのいくつかの重要なステップがあります。動物キャップからの深い外因性細胞の分離中に表面上皮細胞の汚染を防ぐために、ステレオスコープの下でカルシウムおよびマグネシウムフリーDFAに入れられた動物キャップを監視し、動物帽の暗色色顔料表層の分離を開始する適切なタイミングを検出する必要があります。組織がカルシウムおよびマグネシウムフリーDFAにあまりにも長く保たれている場合、組織全体が解離し、深い外皮凝集体では深い細胞と表面的な細胞を区別することは不可能であろう。深い外胚体凝集体に表面細胞がないことを確認するために、マイクロサージャリーの前に、胚の頂端表面にNHS-ローダミン(ステップ1.414)を蛍光的に標識することをお勧めします。これにより、結果として得られたオルガノイドに存在する場合、表面細胞を容易に同定することができます。上皮再生は組織力学14によって調節されるため、自己組織化オルガノイドに対する意図しない力の発生を避けるために不可欠である。特に、ライブ凝集体の撮像窓との自由な接触を可能にするため、ライブイメージング中に、ライブイメージングチャンバのガラス底面との接触を避けることを提案する。このin vitro–粘液性上皮の培養された自己組織化された3Dモデルは、上皮の再生およびゴブレット細胞の系統指定の間に生じる基本的な質問に答える難解なツールとして機能する。
The authors have nothing to disclose.
キム・ラボとランス・デイビッドソンのメンバーのコメントとサポートに感謝します。この研究は、基礎科学研究所(IBS-R0250Y1)からHYKにヤングサイエンティストフェローシップによって支援されました。
Equipment | |||
Dual-stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-100 | |
Picoliter microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
Confocal Laser Microscope | |||
Stereoscope | |||
Tools | |||
Forcep | Dumont | Dumont #5 | |
Hair knife | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
Hair loop | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
hCG injection | |||
human chorionic gonadotropin | Sigma | cg10-10vl | |
MBS solution | |||
10M Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Calcium nitrate | Sigma | C1396 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Phenol-red | Sigma | P0290 | |
Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g | Sigma | 655104 | |
dejellying solution | |||
L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
Sodium hydroxide 10M | Sigma | 72068 | |
Ficoll solution | |||
Ficoll | Sigma | F4375 | |
DFA solution | |||
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
0.22mm Filter | Millipore | S2GPT05RE | |
Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | |
Bicine | Sigma | B3876 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
Sodium carbonate | Sigma | 222321 | |
Sodium gluconate | Sigma | G9005 | |
mRNA in vitro transcription | |||
SP6/T7 in vitro transcription kit | Invitrogen | AM1340 | |
mRNA microinjection | |||
Borosilicate glass capillary tubes | Harvard Apparatus | GC100-10 | |
Eppendorf microloader pipette tips | ThermoFisher | A25547 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | |
PCR tube coating | |||
BSA | Thermofisher | 26140079 | |
PCR tubes | SSI | SSI-3245-00 | |
Imaging | |||
Custom-milled acrylic chamber | |||
Coverglass 24mmX50mm | Duran | B01_001650 | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh) | SPI | 275HGN-XA | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh) | SPI | 2775GN-XA | |
Silicone grease | Shinetsu | HIVAC-G | |
Fixation | |||
20ml screw top-cap vial | Wheaton | WH.986580 | |
2ml screw top-cap vial | |||
Benzyl alcohol | Sigma | 305197 | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sgima | D4540 | |
Glutaraldehyde 10% EM GRADE | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
Goat serum | Jackson | 005-000-121 | |
Methanol | Sigma | 322415 | |
Paraforlamdehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | LPS Solution | CBP007B | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Primary antibody (1:200) | |||
acetylated tubulin | Sigma | clone 6-11B-1 | |
Itln1 | Proteintech | 11770-1-AP | |
Keratin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1h5 | |
ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
Vectors | |||
pCS2-mem-GFP | Gift from Dr. Lance Davidson | ||
pCS2-ZO1-RFP | Gift from Dr. Lance Davidson |