Vi beskriver ett enkelt protokoll för att utveckla mucociliary epitelial organoids från djupa ectoderm celler isolerade från Xenopus laevis embryon. De multipotenta progenitorerna regenererar epitelcellercellprekursorer och möjliggör livespårning av cellövergångarnas initiering och progression på ytan av organoider.
Mucociliary epitel ger den första försvarslinjen genom att avlägsna främmande partiklar genom verkan av slem produktion och cilier-medierad clearance. Många kliniskt relevanta defekter i mucociliary epitel är härledas som de uppstår djupt inne i kroppen. Här introducerar vi en tractable 3D-modell för mucociliary epitel genereras från multipotenta progenitors som var microsurgically isolerade från Xenopus laevis embryon. Den mucociliary epitelial organoids är täckta med nyligen genererade epitel från djupa ektoderm celler och senare dekorerade med distinkt mönstrade multiciliated celler, sekretoriska celler och slem-producerande bökceller som är omöjlig att skilja från den inhemska epidermis inom 24 h. De fullständiga sekvenserna av dynamiska cellövergångar från mesenkymalt till epitelial som framträder på den apikala ytan av organoider kan spåras av högupplöst live imaging. Dessa in vitro odlade, självorganiserande mucociliary epitelial organoids erbjuder distinkta fördelar i att studera biologi mucociliary epitel med högeffektiv i generation, definierade odlingsförhållanden, kontroll över antal och storlek, och direkt tillgång för levande bildbehandling under regenerering av den differentierade epitel.
Skada, infektion, och sjukdom av mucociliary epitel är associerade med försämrad produktion och clearance av slem som ofta finns i lungsjukdomar såsom kronisk obstruktiv lungsjukdom, astma, cystisk fibros, bronkiektasier, och primära ciliary dyskinesi1,2,3,4. En nyligen framsteg i organoid teknik, till exempel, den basala cellen härledda lungorganoid kallas tracheosphere som rekapitulerar regenerering av mucociliary epitel uppstå som en lovande modell med terapeutisk potential1,5,6. Dess användning är dock för närvarande begränsad, delvis på grund av brist på de definierade odlingsförhållandena och låg effektivitet i organoidproduktioner. Mucociliary epitel i den mänskliga luftvägarna och groda epidermis är anmärkningsvärt lika i vävnad morfologi, cellulär sammansättning, och dessfunktion 7,8,9,10,11,12. I båda organismerna ger mucociliary epitel första linjens försvar genom att utsöndra slem och antimikrobiella ämnen och rensar skadliga partiklar och patogener genom synkroniserade verkan av cilier.
Här beskriver vi ett enkelt protokoll för att generera mucociliary epitelial organoids med hjälp av de multipotenta progenitors av Xenopus laevis embryon13,14. Tidigare rapporteradevi 14 att i avsaknad av exogena tillväxtfaktorer och den extracellulära matrisen, de microsurgically isolerade djupa celler från den tidiga gastrula skede ectoderm spontant montera i aggregat, regenerera epitel på dess yta och mogna till mucociliary epitel genom att intercalating multiciliated och andra tillbehör celler inom 24 h. Förutom den snabba utvecklingen erbjuder detta protokoll en tydlig möjlighet att direkt få tillgång till övergångar av multipotenta djupa ektodermceller till epitelfadercellsfaderner som rekapitulerar regenereringsstegen i ett stört epitel14 som inte är tillgängliga från intakta embryon och ektoderm (även känt som djurkapslar)15,16,17. Numrera och storleksanpassa av organoidsna som produceras, är scalable med kickeffektivitet, genom att kontrollera startmaterialen från Xenopus embryon. Organoider i flytande kultur kan enkelt sorteras och överföras på önskat stadium för ytterligare analyser, inklusive högupplöst bildbehandling, mekanisk testning, läkemedelsbehandling, och genetisk karakterisering14. Denna spontana, vävnad mekanik-driven regenerering av epitelet på ytan av embryonala cell aggregat resulterar i mucociliary epitelial organoids och ge en ny tredimensionell (3D) modell för att studera biologi mucociliary epitel.
Mucociliary epitelial organoider som genereras från djupa ektoderm celler av X. laevis embryo är ett kraftfullt verktyg för att studera epitelialization och differentiering av multipotenta progenitors in vitro. I motsats till den allmänt antagna djurmössanassay 16 används för in vitro organogenes13 och utvecklingen av mucociliary epithelia15,17,22 som utnyttjar intakt ektoderm, den djupa ektoderm-härledda organoider som presenteras i detta protokoll erbjuder en distinkt möjlighet att övervaka vävnadmekanik-driven regenerering faser av ytan epitel14. Vid omkring 2 hpa börjar de nygenererade ZO-1 positiva epitelcellerna (Figur 2) att dyka upp på den apikala ytan av organoider och öka deras befolkning för att täcka hela organoiden då vävnaden stelnar eller minskar efterlevnaden14. Regenereringen av epitelet och efterföljande lingsspecifikationer för slemproducerande biskceller fortsätter spontant i ett kemiskt definierat odlingsmedier inom en dag. Dessa snabbt utveckla mucociliary epitelial organoids ger en plattform för att undersöka dynamiska cell beteenden i realtid, i hög upplösning, under progressiva steg av epitelial regenerering. De möjliggör också utredning av grundläggande frågor som uppstår under mucociliary epitel utveckling, homeostas, och associerade sjukdomar2,9,23. I synnerhet kan den mekaniska känsligheten hos de djupa progenitorcellerna under övergången till epitelcellers prekursorer som identifieras i organoiderna14 tjäna till att länka luftvägssjukdomar som är associerade med onormal basal differentiering där slemsöndrar bingelceller är över- eller underproducerade23.
Medan detta protokoll erbjuder en enkel metod för att generera dessa organoider, Det finns flera kritiska steg för framgång i experiment. För att förhindra kontaminering av ytliga epitelceller under isoleringen av djupa ektodermceller från djurlocket bör man övervaka det djurlock som placerats i kalcium- och magnesiumfritt DFA under ett stereoskop och upptäcka rätt tid för att initiera separationen av det mörkpigmenterade ytliga skiktet av djurlocket. Om vävnaden hålls i kalcium- och magnesiumfri DFA för länge, kommer hela vävnaden att separera och skilja mellan djupa och ytliga celler skulle då vara omöjligt för djupa ektoderm aggregat. För att bekräfta frånvaron av ytliga celler i djupa ektoderm aggregat, rekommenderar vi fluorescerande märkning den apikala ytan av embryot med NHS-rhodamin (steg 1,414) före mikrokirurgi; detta skulle möjliggöra enkel identifiering av ytceller om de finns i de resulterande organoiderna. Eftersom epitelial regenerering regleras avvävnadsmekanik 14, är det viktigt att undvika oavsiktlig kraftgenerering för självorganiserande organoider. I synnerhet föreslår vi att undvika kontakt med glaset botten av bildbehandling kammaren under levande bildbehandling genom att placera aggregat vid kanterna av TEM rutnäten eftersom detta möjliggör fri kontakt med bildframställning fönster live aggregat (steg 5.1.2.). Detta in vitro–odlade, självorganiserade 3D-modell för mucociliary epitel kommer att fungera som ett tractable verktyg för att besvara de grundläggande frågor som uppstår under regenerering av epitel och härstamning specifikationen av bägare celler.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar medlemmar av Kim lab och Lance Davidson för deras kommentarer och stöd. Detta arbete stöddes av Young Scientist Fellowship till HYK från Institute for Basic Science (IBS-R0250Y1).
Equipment | |||
Dual-stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-100 | |
Picoliter microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
Confocal Laser Microscope | |||
Stereoscope | |||
Tools | |||
Forcep | Dumont | Dumont #5 | |
Hair knife | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
Hair loop | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
hCG injection | |||
human chorionic gonadotropin | Sigma | cg10-10vl | |
MBS solution | |||
10M Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Calcium nitrate | Sigma | C1396 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Phenol-red | Sigma | P0290 | |
Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g | Sigma | 655104 | |
dejellying solution | |||
L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
Sodium hydroxide 10M | Sigma | 72068 | |
Ficoll solution | |||
Ficoll | Sigma | F4375 | |
DFA solution | |||
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
0.22mm Filter | Millipore | S2GPT05RE | |
Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | |
Bicine | Sigma | B3876 | |
Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
Potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
Sodium carbonate | Sigma | 222321 | |
Sodium gluconate | Sigma | G9005 | |
mRNA in vitro transcription | |||
SP6/T7 in vitro transcription kit | Invitrogen | AM1340 | |
mRNA microinjection | |||
Borosilicate glass capillary tubes | Harvard Apparatus | GC100-10 | |
Eppendorf microloader pipette tips | ThermoFisher | A25547 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | |
PCR tube coating | |||
BSA | Thermofisher | 26140079 | |
PCR tubes | SSI | SSI-3245-00 | |
Imaging | |||
Custom-milled acrylic chamber | |||
Coverglass 24mmX50mm | Duran | B01_001650 | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh) | SPI | 275HGN-XA | |
SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh) | SPI | 2775GN-XA | |
Silicone grease | Shinetsu | HIVAC-G | |
Fixation | |||
20ml screw top-cap vial | Wheaton | WH.986580 | |
2ml screw top-cap vial | |||
Benzyl alcohol | Sigma | 305197 | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sgima | D4540 | |
Glutaraldehyde 10% EM GRADE | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
Goat serum | Jackson | 005-000-121 | |
Methanol | Sigma | 322415 | |
Paraforlamdehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | LPS Solution | CBP007B | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Primary antibody (1:200) | |||
acetylated tubulin | Sigma | clone 6-11B-1 | |
Itln1 | Proteintech | 11770-1-AP | |
Keratin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1h5 | |
ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
Vectors | |||
pCS2-mem-GFP | Gift from Dr. Lance Davidson | ||
pCS2-ZO1-RFP | Gift from Dr. Lance Davidson |