Analyse af α-Actinin Network i Human iPSC-Afledte Kardiomyocytter ved hjælp af enkelt molekyle lokalisering mikroskopi
Summary
Dannelsen af et ordentligt sarkomnetværk er vigtig for modningen af iPSC-afledte kardiomyocytter. Vi præsenterer en super opløsning-baseret tilgang, der giver mulighed for kvantitativ evaluering af den strukturelle modning af stamceller afledte kardiomyocytter, for at forbedre kultur betingelser fremme hjerteudvikling.
Abstract
Modningen af iPSC-afledte kardiomyocytter er et kritisk problem for deres anvendelse i regenerativ behandling, testning af lægemidler og sygdomsmodellering. På trods af udviklingen af flere differentieringsprotokoller er genereringen af iPSC-kardiomyocytter, der ligner en voksenlignende fænotype, fortsat udfordrende. Et vigtigt aspekt af cardiomyocytes modning indebærer dannelsen af et velorganiseret sarcomere netværk for at sikre høj sammentrækningskapacitet. Her præsenterer vi en super løsningsbaseret tilgang til semi-kvantitativ analyse af α-actinin-netværket i kardiomyocytter. Ved hjælp af fotoaktiveret lokaliseringmikroskopi blev der foretaget en sammenligning af sarkomiske længde- og z-disc-tykkelse af iPSC-afledte kardiomyocytter og hjerteceller, der var isoleret fra neonatal væv. Samtidig viser vi vigtigheden af ordentlige billeddannelsesforhold for at opnå pålidelige data. Vores resultater viser, at denne metode er egnet til kvantitativt at overvåge den strukturelle modenhed af hjerteceller med høj rumlig opløsning, så detektion af selv subtile ændringer af sarcomere organisation.
Introduction
Hjerte-kar-sygdomme (CVD) såsom myokardie infarkt eller kardiomyopati fortsat den vigtigste dødsårsag i den vestlige verden1. Da det menneskelige hjerte kun har dårlig regenerativ kapacitet, er der behov for strategier til at fremme inddrivelsen fra CV’er. Dette omfatter celle udskiftning behandlingsformer til at genopbygge tabte kardiomyocytter (CM), samt udvikling af nye anti-arytmiske lægemidler til effektiv og sikker farmaceutisk intervention. Induceret pluripotent stamceller (iPSC) har vist sig at være en lovende cellekilde for den ubegrænsede generation af humane CM in vitro, egnet til regenerative behandlinger, sygdom modellering, og til udvikling af narkotika screening assays2,3,4.
Selv om mange forskellige hjerte differentiering protokoller findes, iPSC-afledte CM stadig mangler visse fænotypiske og funktionelle aspekter, der hindrer in vitro og in vivo ansøgning5,6. Udover elektrofysiologiske, metaboliske og molekylære ændringer, hjertet modning proces indebærer den strukturelle organisering af sarcomeres, som er de grundlæggende enheder, der kræves for kraft generation og celle sammentrækning7. Mens voksne CMs udviser et velorganiseret kontraktapparat, iPSC-afledte CMs ofte demonstrere disarranged sarcomere filamenter, forbundet med en reduceret sammentrækning evne og ændret sammentrækning dynamik8,9. I modsætning til modne CM, der viser uniaxial sammentrækning mønster, de desorienterede strukturer i umodne CM resulterer i en radial sammentrækning af hele cellen eller fremme udseendet af sammentrækningknudepunkter 9,10.
For at forbedre hjertemodning, flere tilgange er blevet anvendt, herunder 3D-celle kultur metoder, elektrisk og mekanisk stimulation, samt brugen af ekstracellulære matricer efterligne in vivo betingelser11,,12,13. For at vurdere disse forskellige kulturbetingelsers succes og effektivitet er der behov for teknikker til at overvåge og vurdere graden af den strukturelle modning af iPSC CM, f.eks. I modsætning til konventionel konfokal billeddannelse er opløsningen i tilfælde af fotoaktiveret lokaliseringmikroskopi (PALM) ca. 10 x højere. Denne teknik giver igen mulighed for en mere præcis analyse, opdage selv subtile ændringer af cellulære strukturer14. I betragtning af den høje opløsning af PALM-baseret billeddannelse, det overordnede mål med denne metode var den mikroskopiske evaluering af sarcomere modenhed i iPSC-afledte CMs ved præcis bestemmelse af z-Disc tykkelse og sarcomere længde. I tidligere undersøgelser har disse strukturelle træk vist sig at være egnede parametre til vurdering af hjertemodenhed15. For eksempel, syge iPSC-CM mangler fuld længde dystrophin udviser reduceret sarcomere længde og z-band bredde i forhold til vilde type celler16. Ligeledes blev længden af de enkelte sarcomeres målt for at undersøge virkningen af topografiske signaler på hjerteudvikling16. Derfor har vi anvendt denne tilgang til at evaluere den strukturelle modning af sarcomere netværket i iPSC-CM ved kvantitativt at måle sarcomere længde og z-disc tykkelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generering af funktionelt iPSC-afledt CM in vitro er vigtigt for regenerative behandlinger, sygdomsmodellering og udvikling af lægemiddelscreeningsplatforme. Utilstrækkelig modenhed af disse cm er imidlertid en væsentlig hindring for hjerte-kar-forskning20. I den forbindelse er der behov for billeddannelsesteknikker med høj opløsning, som gør det muligt at overvåge den strukturelle modningstilstand for iPSC-afledt cm. Samtidig kan superopløsningsmikroskopi være et værdifuldt redskab til …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af EU’s strukturfond (ESF/14-BM-A55-0024/18). Derudover støttes H.L. af FORUN-programmet for Rostock University Medical Centre (889001 og 889003) og Josef og Käthe Klinz Foundation (T319/29737/2017). C.I.L. er støttet af Clinician Scientist Program af Rostock University Medical Center. R.D støttes af DFG (DA1296/6-1), DAMP Foundation, German Heart Foundation (F/01/12) og BMBF (VIP+ 00240).
Vi takker Madeleine Bartsch for hendes tekniske support i iPSC cellekultur og hjertedifferentiering.
Materials
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
References
- McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
- Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
- Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
- Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
- Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
- Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
- Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
- Fornasiero, E. F., Opazo, F., Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. , (2015).
- Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
- Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
- Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
- Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
- Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
- Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
- Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
- McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).
