一分子局在顕微鏡を用いたヒトiPSC由来心筋細胞におけるαアクチニンネットワークの解析
Summary
適切なサルコメアネットワークの形成は、iPSC由来心筋細胞の成熟にとって重要である。我々は、心臓の発達を促進する培養条件を改善するために、幹細胞由来心筋細胞の構造成熟の定量的評価を可能にする超解像ベースのアプローチを提示する。
Abstract
iPSC由来心筋細胞の成熟は、再生療法、薬物検査および疾患モデリングにおける応用において重要な課題である。複数の分化プロトコルが発達しているにもかかわらず、成人のような表現型に似たiPSC心筋細胞の生成は依然として困難である。心筋細胞成熟の主要な側面の1つは、高い収縮能力を確保するためによく組織されたサルコメアネットワークの形成を含む。ここでは、心筋細胞におけるαアクチニンネットワークの半定量的解析のための超解像ベースのアプローチを提示する。光活性化局在化顕微鏡を用いて、新生児組織から分離したiPSC由来心筋細胞と心臓細胞のサルコメア長さおよびZ-ディスク厚さの比較を行った。同時に、信頼性の高いデータを得るための適切なイメージング条件の重要性を示しています。我々の結果は、この方法が高い空間分解能を有する心細胞の構造的成熟度を定量的に監視するのに適しており、サルコメア組織の微妙な変化を検出することを可能にすることを示している。
Introduction
心筋梗塞や心筋症などの心血管疾患(CVD)は、西洋世界における主要な死因である。人間の心臓は再生能力が乏しいだけであるため、CVDからの回復を促進する戦略が必要です。これには、失われた心筋細胞(CM)を補充するための細胞置換療法と、効率的かつ安全な医薬品介入のための新しい抗不整脈薬の開発が含まれます。誘導多能性幹細胞(iPSC)は、ヒトCMインビトロでの無限の生成のための有望な細胞源であることが示されており、再生療法、疾患モデリング、および薬物スクリーニングアッセイ22、3、43,4の開発に適している。
多くの異なる心臓分化プロトコルが存在するが、iPSC由来のCMは、インビトロおよびインビボアプリケーション55、66を妨げる特定の定型的および機能的な側面をまだ欠いている。電気生理学的、代謝的、および分子変化に加えて、心臓成熟プロセスは、力の生成および細胞収縮に必要な基本的な単位であるサルコメアの構造組織を含む7。成人のCMは、よく組織された収縮装置を示すが、iPSC由来のCMは、収縮能力の低下および収縮性の変化に関連するサルコメアフィラメントの配置解除を一般に示す。,9単軸収縮パターンを示す成熟CMとは対照的に、未熟CMにおける混乱した構造は、細胞全体の径方向収縮を生じ、または収縮焦点99,1010の出現を促進する。
心臓成熟を改善するために、3D細胞培養法、電気的および機械的刺激、ならびに生体内条件11、12、13,12,13における細胞外マトリックスを模倣する細胞外マトリックスの使用を含む、複数のアプローチが適用されている。これらの異なる培養条件の成功と効率を評価するためには、iPSC CMの構造成熟度を監視および推定する技術が必要です。従来の共焦点イメージングとは対照的に、光活性化局在化顕微鏡(PALM)の場合の分解能は約10倍高い。この技術は、細胞構造の微妙な変化を検出し、より正確な分析を可能にします14.PALMベースのイメージングの高解像度を考慮すると、この方法の全体的な目標は、zディスクの厚さとサルコメアの長さの正確な決定によるiPSC由来CDのサルコメア成熟度の顕微鏡的評価でした。これまでの研究では、これらの構造的特徴は、心の成熟度15を評価するための適切なパラメータであることが示されている。例えば、全長のジストロフィンを欠いた疾患のiPSC-CMは、野生型細胞16と比較した場合にサルコメア長さおよびzバンド幅を減少させた。同様に、個々のサルコメアの長さを測定し、心臓発達16に対する地形の手掛かりの影響を調べた。そこで、サルコメアの長さとzディスクの厚さを定量的に測定することにより、iPSC-CMにおけるサルコメアネットワークの構造成熟を評価するためにこのアプローチを適用しました。
Protocol
新生児マウスと成体マウスを含むこのプロトコルのすべてのステップは、ロストック大学医療センターの動物ケアのための倫理ガイドラインに従って行われました。 1. iPSC由来心筋細胞の培養と解離 前述の2D単層法を使用して hiPSC-CM を 25 日間区別します。 前温解離媒体を37°Cにし、培地を室温まで支持する。 PBSで細胞を2回洗浄し…
Representative Results
CMの構造成熟度を推定するために、新生児、完全に成熟した成人、およびiPSC CMは、最初に、サルコメアネットワークを視覚化するためにαアクチニン抗体でCMに標識した。PALMの取得後、画像を再構築し、個々のフィラメントの幅を自動検出するためのプラグインベースの画像処理ソフトウェアを用いてZディスク厚さを測定した。サルコメア長さは、隣接するフィラメントに対応する2つの隣接…
Discussion
iPSC由来のCM in vitroの生成は、再生療法、疾患モデリング、薬物スクリーニングプラットフォームの開発にとって重要です。しかし、これらのCMの成熟度が不十分な心血管研究20における大きな障害である。この点に関して、iPSC由来CMの構造成熟状態のモニタリングを可能にする高分解能イメージング技術が必要である。同時に、超分解能顕微鏡は、チチンおよびトロポニン<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、EU構造基金(ESF/14-BM-A55-0024/18)によって支援されました。さらに、H.L.はロストック大学医療センター(889001および889003)のFORUNプログラムとヨーゼフとケーテ・クリンツ財団(T319/29737/2017)によってサポートされています。C.I.L.は、ロストック大学医療センターの臨床医科学者プログラムによってサポートされています。R.DはDFG(DA1296/6-1)、DAMP財団、ドイツ心臓財団(F/01/12)、BMBF(VIP+ 00240)によってサポートされています。
マドレーヌ・バルチュは、iPSC細胞培養と心臓分化における彼女の技術サポートに感謝します。
Materials
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
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Cite This Article
Johann, L., Chabanovska, O., Lang, C. I., David, R., Lemcke, H. Analyzing the α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy. J. Vis. Exp. (165), e61605, doi:10.3791/61605 (2020).