एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में α-Actinin नेटवर्क का विश्लेषण
Summary
आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की परिपक्वता के लिए उचित सारकोमेरे नेटवर्क का गठन महत्वपूर्ण है। हम एक सुपर संकल्प आधारित दृष्टिकोण पेश करते हैं जो हृदय विकास को बढ़ावा देने वाली संस्कृति स्थितियों में सुधार करने के लिए स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की संरचनात्मक परिपक्वता के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।
Abstract
आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की परिपक्वता पुनर्योजी चिकित्सा, दवा परीक्षण और रोग मॉडलिंग में उनके आवेदन के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा है। कई भेदभाव प्रोटोकॉल के विकास के बावजूद, वयस्क जैसे फेनोटाइप जैसी आईपीएससी कार्डियोमायोसाइट्स की पीढ़ी चुनौतीपूर्ण बनी हुई है। कार्डियोमायोसाइट्स परिपक्वता के एक प्रमुख पहलू में उच्च संकुचन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए एक अच्छी तरह से संगठित सारकोमेरे नेटवर्क का गठन शामिल है। यहां, हम कार्डियोमायोसाइट्स में α-ऐक्टिनिन नेटवर्क के अर्ध-मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक सुपर रिज़ॉल्यूशन-आधारित दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। फोटोएक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके नवजात ऊतक से अलग किए गए आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स और कार्डियक कोशिकाओं की सारकोमेरे लंबाई और जेड-डिस्क मोटाई की तुलना की गई। साथ ही, हम विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए उचित इमेजिंग स्थितियों के महत्व को प्रदर्शित करते हैं। हमारे परिणाम बताते हैं कि यह विधि उच्च स्थानिक संकल्प के साथ हृदय कोशिकाओं की संरचनात्मक परिपक्वता की मात्रात्मक रूप से निगरानी करने के लिए उपयुक्त है, जिससे सारकोमेरे संगठन के सूक्ष्म परिवर्तनों का पता लगाया जा सके।
Introduction
हृदय रोग (सीवीडी) जैसे मायोकार्डियल इंफार्क्शन या कार्डियोमायोपैथी पश्चिमी दुनिया में मौत का प्रमुख कारण बने हुए हैं1। चूंकि मानव हृदय में केवल खराब पुनर्योजी क्षमता है, इसलिए सीवीडी से वसूली को बढ़ावा देने के लिए रणनीतियों की आवश्यकता है। इसमें खोए हुए कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) को भरने के साथ-साथ कुशल और सुरक्षित दवा हस्तक्षेप के लिए नई एंटी-अतालता दवाओं के विकास के लिए सेल रिप्लेसमेंट उपचार शामिल हैं। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) को विट्रो में मानव मुख्यमंत्री की असीमित पीढ़ी के लिए एक आशाजनक सेल स्रोत के रूप में दिखाया गया है, जो पुनर्योजी चिकित्सा, रोग मॉडलिंग के लिए उपयुक्त है, और दवा स्क्रीनिंग के विकास के लिए2,,3,,4।
यद्यपि कई अलग-अलग कार्डियक विभेदक प्रोटोकॉल मौजूद हैं, आईपीएससी-व्युत्पन्न सीएम में अभी भी कुछ फेनोटाइपिकल और कार्यात्मक पहलुओं की कमी है जो इन विट्रो और वीवो एप्लिकेशन5,,6में बाधा डालते हैं। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिक, मेटाबोलिक और आणविक परिवर्तनों के अलावा, हृदय परिपक्वता प्रक्रिया में सारकोर्स का संरचनात्मक संगठन शामिल है, जो बल उत्पादन और सेल संकुचन7के लिए आवश्यक मौलिक इकाइयां हैं। जबकि वयस्क सीएम एक अच्छी तरह से संगठित संकुचन तंत्र प्रदर्शित करते हैं, आईपीएससी-व्युत्पन्न सीएम आमतौर पर एक कम संकुचन क्षमता और परिवर्तित संकुचन गतिशीलता8,,9से जुड़े अव्यवस्थित सारकोमेरे तंतुओं का प्रदर्शन करते हैं। परिपक्व सीएम के विपरीत जो एकात्मक संकुचन पैटर्न दिखाते हैं, अपरिपक्व सीएम में विकेंद्रित संरचनाओं के परिणामस्वरूप पूरे सेल का एक रेडियल संकुचन होता है या संकुचन फोकलपॉइंट्स 9,,10की उपस्थिति को बढ़ावा देता है।
हृदय परिपक्वता में सुधार के लिए, कई दृष्टिकोण लागू किए गए हैं, जिनमें 3 डी सेल संस्कृति विधियां, विद्युत और यांत्रिक उत्तेजना, साथ ही वीवो स्थितियों में नकल करने वाले एक्सेलैल्युलर मैट्रिस का उपयोग11,12,,13शामिल हैं।, इन विभिन्न संस्कृति स्थितियों की सफलता और दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, सूक्ष्म तकनीकों द्वारा आईपीएससी सीएम की संरचनात्मक परिपक्वता की डिग्री की निगरानी और अनुमान लगाने के लिए तकनीकों की आवश्यकता होती है। पारंपरिक कॉन्फोकल इमेजिंग के विपरीत, फोटोएक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (पाम) के मामले में संकल्प लगभग 10x अधिक है। बदले में यह तकनीक अधिक सटीक विश्लेषण की अनुमति देती है, सेलुलर संरचनाओं के सूक्ष्म परिवर्तन का भी पता लगाती है14। पाम आधारित इमेजिंग के उच्च संकल्प को ध्यान में रखते हुए, इस विधि का समग्र लक्ष्य जेड-डिस्क मोटाई और सारकोर लंबाई के सटीक निर्धारण द्वारा आईपीएससी-व्युत्पन्न सीएम में सारकोमे परिपक्वता का सूक्ष्म मूल्यांकन था। पिछले अध्ययनों में, इन संरचनात्मक विशेषताओं को कार्डियक परिपक्वता15का आकलन करने के लिए उपयुक्त पैरामीटर दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, रोगग्रस्त आईपीएससी-सीएम में पूरी लंबाई की कमी डिस्ट्रोफिन प्रदर्शन ने जंगली प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में सारकोमेरे लंबाई और जेड-बैंड चौड़ाई कम करदी 16। इसी तरह, हृदय विकास16पर स्थलाकृतिक संकेतों के प्रभाव की जांच करने के लिए व्यक्तिगत सारकोमर की लंबाई मापी गई थी। इसलिए, हमने इस दृष्टिकोण को आईपीएससी-सीएम में सारकोमेरे नेटवर्क की संरचनात्मक परिपक्वता का मूल्यांकन करने के लिए मात्रात्मक रूप से सारकोमेरे लंबाई और जेड-डिस्क मोटाई को मापने के लिए लागू किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
कार्यात्मक आईपीएससी-व्युत्पन्न सीएम इन विट्रो का उत्पादन पुनर्योजी चिकित्सा, रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, इन सीएम की अपर्याप्त परिपक्वता हृदय …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को ईयू स्ट्रक्चरल फंड (ESF/14-BM-A55-0024/18) ने समर्थन दिया था । इसके अलावा, एच.एल. रोस्टॉक विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र (889001 और 889003) और जोसेफ और Käthe Klinz Foundation (T319/29737/2017) के FORUN कार्यक्रम द्वारा समर्थित है। C.I.L. रोस्टॉक विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र के चिकित्सक वैज्ञानिक कार्यक्रम द्वारा समर्थित है। आर डी DFG (DA1296/6-1), नम फाउंडेशन, जर्मन हार्ट फाउंडेशन (F/01/12) और बीएमबीएफ (वीआईपी + ००२४०) द्वारा समर्थित है ।
हम आईपीएससी सेल संस्कृति और हृदय भेदभाव में उसकी तकनीकी सहायता के लिए Madeleine Bartsch शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
References
- McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
- Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
- Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
- Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
- Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
- Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
- Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
- Fornasiero, E. F., Opazo, F., Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. , (2015).
- Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
- Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
- Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
- Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
- Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
- Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
- Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
- McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).
