Analysere det α-Actinin-nettverket i humane iPSC-avledede kardiomyocytter ved hjelp av enkeltmolekyl lokalisering mikroskopi

Summary

Dannelsen av et skikkelig sarcomere-nettverk er viktig for modning av iPSC-avledede kardiomyocytter. Vi presenterer en super oppløsningsbasert tilnærming som muliggjør kvantitativ evaluering av den strukturelle modningen av stamcelleavledede kardiomyocytter, for å forbedre kulturforhold som fremmer hjerteutvikling.

Abstract

Modningen av iPSC-avledede kardiomyocytter er et kritisk problem for deres anvendelse i regenerativ terapi, narkotikatesting og sykdomsmodellering. Til tross for utviklingen av flere differensieringsprotokoller, er generasjonen av iPSC kardiomyocytter som ligner en voksenlignende fenotype fortsatt utfordrende. Et viktig aspekt ved kardiomyocytter modning innebærer dannelsen av et godt organisert sarcomere-nettverk for å sikre høy sammentrekningskapasitet. Her presenterer vi en super oppløsningsbasert tilnærming for semi-kvantitativ analyse av α-actinin-nettverket i kardiomyocytter. Ved hjelp av fotoaktivert lokalisering mikroskopi en sammenligning av sarcomere lengde og z-plate tykkelse av iPSC-avledet kardiomyocytter og hjerteceller isolert fra neonatal vev ble utført. Samtidig viser vi viktigheten av riktige bildeforhold for å oppnå pålitelige data. Våre resultater viser at denne metoden er egnet til å kvantitativt overvåke den strukturelle modenheten til hjerteceller med høy romlig oppløsning, slik at påvisning av selv subtile endringer i sarcomere-organisasjonen.

Introduction

Kardiovaskulære sykdommer (CVD) som hjerteinfarkt eller kardiomyopati er fortsatt den viktigste dødsårsaken i den vestlige verden¹. Som det menneskelige hjerte har bare dårlig regenerativ kapasitet, det er behov for strategier for å fremme utvinning fra CVDer. Dette inkluderer celleerstatningsterapi for å fylle opp tapte kardiomyocytter (CM), samt utvikling av nye antiarytmiske legemidler for effektiv og sikker farmasøytisk inngrep. Indusert pluripotente stamcelle (iPSC) har vist seg å være en lovende cellekilde for ubegrenset generasjon av human CM in vitro, egnet for regenerative terapier, sykdomsmodellering og for utvikling av legemiddelscreeninganalyser^2,3,4.

Selv om mange forskjellige hjertediensiasjonsprotokoller finnes, mangler iPSC-avledet CM fortsatt visse fenotypiske og funksjonelle aspekter som emmer in vitro- og in^{vivo-applikasjonen 5,,6}. Ved siden av elektrofysiologiske, metabolske og molekylære endringer innebærer hjertemodningsprosessen den strukturelle organiseringen av sarkomer, som er de grunnleggende enhetene som kreves for kraftgenerering og cellesammentrekning⁷. Mens voksne CMs viser et godt organisert kontraktilt apparat, viser iPSC-avledede CMs ofte uarrangerte sarcomere-filamenter, forbundet med redusert sammentrekningsevne og endret sammentrekningsdynamikk^8,,9. I motsetning til modne CM som viser enaksial sammentrekningsmønster, resulterer de desorienterte strukturene i umodne CM i en radial sammentrekning av hele cellen eller fremmer utseendet på sammentrekningsfokus^9,10.

For å forbedre hjertemodning har flere tilnærminger blitt brukt, inkludert 3D-cellekulturmetoder, elektrisk og mekanisk stimulering, samt bruk av ekstracellulære matriser som etterligner in vivoforhold^11,,12,,13. For å evaluere suksessen og effektiviteten til disse ulike kulturforholdene, er det nødvendig med teknikker for å overvåke og estimere graden av den strukturelle modningen av iPSC CM, for eksempel ved mikroskopiske teknikker. I motsetning til konvensjonell konfokal avbildning er oppløsningen ved fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM) omtrent 10x høyere. Denne teknikken gir i sin tur en mer nøyaktig analyse, oppdage selv subtile endringer av cellulære strukturer¹⁴. Tatt i bruk den høye oppløsningen av PALM-basert bildebehandling, var det overordnede målet med denne metoden den mikroskopiske evalueringen av sarcomere modenhet i iPSC-avledede CMer ved presis bestemmelse av z-Disc tykkelse og sarcomere lengde. I tidligere studier har disse strukturelle egenskapene vist seg å være passende parametere for å vurdere hjertemodenhet¹⁵. For eksempel, syk iPSC-CM mangler full lengde dystrophin viser redusert sarcomere lengde og z-band bredde sammenlignet med vill type celler¹⁶. På samme måte ble lengden på individuelle sarkomer målt for å undersøke virkningen av topografiske signaler på hjerteutvikling¹⁶. Derfor brukte vi denne tilnærmingen til å evaluere den strukturelle modningen av sarcomere-nettverket i iPSC-CM ved kvantitativt måling av sarcomere lengde og z-platetykkelse.

Protocol

Alle trinnene i denne protokollen som involverer neonatale og voksne mus ble utført i henhold til de etiske retningslinjene for dyrepleie av Rostock University Medical Centre. 1. Dyrking og dissosiasjon av iPSC-avledede kardiomyocytter Differensier hiPSC-CMs i 25 dager ved hjelp av en 2D-monolayer-metode som beskrevet tidligere17. Prewarm dissosiasjon medium til 37 °C og støtte middels til romtemperatur. Vask celler to ganger med PBS.</l…

Representative Results

For å estimere graden av strukturell modning av CM ble neonatal, fullt moden voksen og iPSC CM opprinnelig merket CM med α-actinin antistoff for å visualisere sarkomerenettverket. Etter PALM-oppkjøpet ble bildene rekonstruert, og z-platetykkelsen ble målt ved hjelp av plugin-basert bildebehandlingsprogramvare for automatisk deteksjon av bredden på individuelle filamenter. Sarcomere lengde ble beregnet ved å måle avstanden mellom to tilstøtende intensitet topper, tilsvarende nærliggende filamenter. <strong class…

Discussion

Genereringen av funksjonell iPSC-avledet CM in vitro er viktig for regenerative terapier, sykdomsmodellering og utvikling av legemiddelscreeningplattformer. Imidlertid er utilstrekkelig modenhet av disse CM et stort hinder i kardiovaskulær forskning²⁰. I denne forbindelse er det nødvendig med høyoppløselige bildeteknikker som muliggjør overvåking av den strukturelle modningstilstanden til iPSC-avledet CM. Samtidig kan superoppløsning mikroskopi være et verdifullt verktøy for å nøyaktig …

Materials

human iPSC cell line	Takara	Y00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottom	ibidi	80827
0.5ml eppendorf tube	Eppendorf	30121023
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A906
Cardiomyocyte Dissociation Kit	Stem Cell Technologies	05025
Catalase	Sigma Aldrich	C40-1G
Cyclooctatetraene	Sigma Aldrich	138924-1G
Cysteamine	Sigma Aldrich	30070-10g
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher	14190169
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647	Thermo Fisher	A-21237
Fiji image processing software (Image J)
Glucose	Carl Roth	X997.2
Hydrochloric acid	Sigma Aldrich	H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 system	Zeiss
Paraformaldehyde	Merck	8187150100
Pyranose oxidase	Sigma Aldrich	P4234-250UN
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53]	Abcam	ab9465
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S7653
sterile water	Carl Roth	3255.1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Trizma base	Sigma Aldrich	T1503
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	63689