Неонатальная модель визуализации грамотрицательных бактериальных сепсисов
Summary
Инфекция неонатальных мышей биолюминесцентной кишечной палочкой O1:K1:H7 приводит к септической инфекции со значительным воспалением легких и патологией легких. Здесь мы описываем процедуры моделирования и дальнейшего изучения неонатального сепсиса с использованием продольной интравитальной визуализации параллельно с перечислением системных бактериальных обременений, воспалительного профилирования и гистопатологии легких.
Abstract
Новорожденные находятся на повышенный риск бактериального сепсиса из-за уникального иммунного профиля они отображают в первые месяцы жизни. Мы установили протокол для изучения патогенеза E. coli O1:K1:H7, серотипа, ответственного за высокие показатели смертности у новорожденных. Наш метод использует интравитаную визуализацию неонатальных щенков в разные моменты времени во время прогрессирования инфекции. Эта визуализация, параллельно с измерением бактерий в крови, воспалительным профилированием и гистопатологией тканей, означает строгий подход к пониманию динамики инфекции во время сепсиса. В настоящем докладе мы моделем два инфекционных инокулума для сравнения бактериального бремени и тяжести заболевания. Мы находим, что подкапулярная инфекция приводит к распространению инфекции на 10 ч после заражения. К 24 ч инфекция люминесцентной кишечной палочки была в изобилии в крови, легких и других периферических тканях. Выражение воспалительных цитокинов в легких является значительным на 24 ч, и это сопровождается клеточной инфильтрации и доказательства повреждения тканей, что увеличивается с инфекционной дозы. Интравитальная визуализация имеет некоторые ограничения. Это включает в себя люминесцентный порог сигнала и некоторые осложнения, которые могут возникнуть с новорожденными во время анестезии. Несмотря на некоторые ограничения, мы находим, что наша модель инфекции предлагает понимание продольной динамики инфекции во время неонатального сепсиса мурина, который не был тщательно изучен до сих пор. Мы ожидаем, что эта модель также может быть адаптирована для изучения других критических бактериальных инфекций в раннем возрасте.
Introduction
Бактериальный сепсис является значительной проблемой для новорожденных, которые демонстрируют уникальный иммунный профиль в первые дни жизни, что не обеспечивает адекватной защиты отинфекции 1. Неонатальный сепсис по-прежнему является важной проблемой здравоохранения США, на которую приходится более 75 000 случаев заболевания в год только вСША 2. Для углубленного изучения этих инфекций необходимы новые модели животных, которые подысовывают аспекты болезней человека. Мы создали модель неонатальной мыши инфекции с использованием Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli является второй ведущей причиной неонатального сепсиса в США, но отвечает за большинство сепсиса связанныхсмертности 4,5. Тем не менее, это ведущая причина, когда досрочные и очень низкой массы тела при рождении (VLBW) дети считаютсясамостоятельно 5. Серотип К1 чаще всего ассоциируется с инвазивными инфекциями кровотока и менингитом у новорожденных6,7. В настоящее время нет других вариантов лечения, кроме антибиотиков и поддерживающей помощи. Между тем, темпы устойчивости к антибиотикам продолжают расти для многих патогенных бактерий, с некоторыми штаммами кишечной палочки устойчивы к множеству антибиотиков, обычно используемых влечении 8. Таким образом, крайне важно, чтобы мы продолжали генерировать методы для изучения механизмов сепсиса и принимающей реакции у новорожденных. Эти результаты могут помочь улучшить текущее лечение и результаты инфекции.
Иммунное состояние новорожденных характеризуется как фенотипическими, так и функциональными различиями по сравнению со взрослыми. Например, повышенные уровни противовоспалительных и нормативных цитокинов, таких как интерлеукин (IL)-10 и IL-27, как было показано, производятся макрофагами, полученными пуповинной кровью, и присутствуют на более высоких уровнях всыворотке крови муринных новорожденных 9,10,11. Это согласуется с более низкими уровнями IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 и TNF-α, которые часто сообщаются из неонатальных клеток по сравнению со взрослымиколлегами 10. Кроме того, неонатальной иммунной системы перекос в сторону Th2 и нормативных Т-клеток ответ по сравнению совзрослыми 12. Повышенное количество нейтрофилов, Т-клеток, В-клеток, НК-клеток и моноцитов также присутствует у новорожденных, но со значительными функциональными нарушениями. Это включает в себя дефекты в выражении маркеров поверхности клеток и антиген презентации, которыепредлагают незрелость 13,14,15. Кроме того, неонатальные нейтрофилов значительно не хватает их способности мигрировать к химиотатическимфакторам 16. Клетки супрессора, полученные из миелоида (MDSCs), также находятся на повышенных уровнях у новорожденных и недавно показали, что источник il-2711. MDSCs являются весьма подавляющим к Т-клеток17. В совокупности эти данные демонстрируют ограничения в неонатальном иммунитете, которые придают повышенную восприимчивость к инфекции.
Для изучения прогрессирования бактериального бремени и вскрытия защитных иммунных реакций хозяина во время неонатального сепсиса, мы разработали новую модель инфекции. Неонатальным мышам в 3-4 дня жизни трудно вводить внутриперитонеашеическое пространство или хвостовую вену. В нашей модели, день 3 или 4 щенков вводят бактериальной инкулум или PBS подкожно в лопаткулярной области. Системная инфекция развивается и с использованием люминесцентной E. coli O1:K1:H7, мы можем продольно изображения отдельных неонатальных мышей следовать распространенной бактериальной нагрузки в периферических тканях. Это первая модель сообщили использовать интравитальной визуализации, чтобы понять кинетику распространения бактерий во время сепсиса в мурине новорожденных3.
Здесь мы описываем протокол, чтобы вызвать септические инфекции кишечной палочки у неонатальных мышей3. Мы описываем, как подготовить бактериальный инокулум к инъекциям, и как собрать ткани для оценки патологии, измерения воспалительных маркеров путем анализа экспрессии генов и перечисления бактериальной нагрузки. Кроме того, описано использование люминесцентной кишечной палочки для интравитальной визуализации инфицированных новорожденных и количественной оценки бактериальных убийств неонатальными иммунными клетками. Эти протоколы также могут быть адаптированы для изучения других важных бактериальных инфекций у новорожденных. Представленные здесь данные представляют собой общий новый подход к пониманию динамики инфекции в переводимой модели неонатального сепсиса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наша модель подкапулярной инфекции для индуцирования бактериального сепсиса у неонатальных мышей является новым методом для изучения продольного распространения бактериальных патогенов в режиме реального времени. Интравитальная визуализация дает возможность исследовать распрост…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана институциональными фондами C.M.R.
Materials
| 1 mL Insulin Syringe | Coviden | 1188128012 | Inoculum or PBS injection |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370-094 | Histopathology |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | LSA1049201 | Bacterial clearance assay |
| Animal Tattoo Ink Paste | Ketchum | KI1482039 | Animal identification |
| Animal Tattoo Ink Green Paste | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
| Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) | N/A | N/A | Constructed in-house at WVU |
| E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
| IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
| IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
| LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
| EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
| SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
| Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
| Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
| TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |
References
- Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
- Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).
- Seman, B. G., et al. Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis. Infections and Immunity. , (2019).
- Schrag, S. J., et al. Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014. Pediatrics. 138 (6), 20162013 (2016).
- Stoll, B. J., et al. Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues. Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).
- Weston, E. J., et al. The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008. Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).
- Hornik, C. P., et al. Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units. Early Human Development. , 69 (2012).
- Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. Neonatal sepsis: an international perspective. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).
- Kraft, J. D., et al. Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses. Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).
- Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune responses in neonates. Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).
- Gleave Parson, M., et al. Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection. Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).
- Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. Neonatal adaptive immunity comes of age. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).
- Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life. Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).
- Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. Defective antigen-presenting cell function in human neonates. Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).
- Le Garff-Tavernier, M., et al. Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span. Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).
- Weinberger, B., et al. Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants. Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).
- Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).
- National Research Council. . Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , (2011).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
- Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context. Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).
- Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors. Journal of Cell Science. 124, 299-310 (2011).
- Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat. Infection and Immunity. 83 (12), 4528 (2015).
- Singh, K., et al. Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice. Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).
- Pluschke, G., Pelkonen, S. Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection. Microb. Patho. , 93-102 (1988).
- Mancuso, G., et al. Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci. Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).
- Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus. Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).
- Andrade, E. B., et al. TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis. Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).
