Un modèle néonatal d’imagerie de la septicémie bactérienne gramnégative
Summary
L’infection des souris néonatales avec E. coli bioluminescent O1:K1:H7 a comme conséquence une infection septique avec l’inflammation pulmonaire significative et la pathologie pulmonaire. Ici, nous décrivons des procédures pour modéliser et étudier davantage la septicémie néonatale utilisant la formation image intravitale longitudinale en parallèle avec l’énumération des charges bactériennes systémiques, du profilage inflammatoire, et de l’histopathologie de poumon.
Abstract
Les nouveau-nés sont à un risque accru de septicémie bactérienne en raison du profil immunitaire unique qu’ils affichent dans les premiers mois de la vie. Nous avons établi un protocole pour étudier la pathogénie de E. coli O1:K1:H7, un sérotype responsable des taux de mortalité élevés chez les nouveau-nés. Notre méthode utilise l’imagerie intravitale des chiots néonatals à différents moments au cours de la progression de l’infection. Cette imagerie, parallèlement à la mesure des bactéries dans le sang, le profilage inflammatoire et l’histopathologie tissulaire, signifie une approche rigoureuse pour comprendre la dynamique de l’infection pendant la septicémie. Dans le présent rapport, nous modélisons deux inoculums infectieux pour la comparaison des fardeaux bactériens et de la gravité de la maladie. Nous constatons que l’infection subscapulaire mène à l’infection disséminée par 10 h après infection. À 24 h, l’infection d’E. coli luminescent était abondante dans le sang, les poumons et d’autres tissus périphériques. L’expression des cytokines inflammatoires dans les poumons est significative à 24 h, et ceci est suivi par l’infiltration cellulaire et l’évidence des dommages de tissu qui augmente avec la dose infectieuse. L’imagerie intravitale a certaines limites. Ceci inclut un seuil de signal luminescent et quelques complications qui peuvent surgir avec des nouveau-nés pendant l’anesthésie. En dépit de quelques limitations, nous trouvons que notre modèle d’infection offre un aperçu pour comprendre la dynamique longitudinale d’infection pendant le sepsis murin néonatal, qui n’a pas été soigneusement examiné jusqu’ici. Nous nous attendons à ce que ce modèle puisse également être adapté pour étudier d’autres infections bactériennes critiques au début de la vie.
Introduction
La septicémie bactérienne est une préoccupation importante pour les nouveau-nés qui présentent un profil immunitaire unique dans les premiers jours de la vie qui ne fournit pas une protection adéquate contre l’infection1. La septicémie néonatale continue d’être un problème de santé important aux États-Unis, représentant plus de 75 000 cas par année aux États-Unisseulement 2. Pour étudier ces infections en profondeur, de nouveaux modèles animaux qui récapitulent des aspects de la maladie humaine sont nécessaires. Nous avons établi un modèle néonatal d’infection de souris utilisant Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli est la deuxième cause de septicémie néonatale aux États-Unis, mais responsable de la majorité de la mortalité associée à la septicémie4,5. Cependant, c’est la cause principale quand les bébés prématurés et très bas de naissance-poids (VLBW) sont considérés indépendamment5. Le sérotype K1 est le plus souvent associé à des infections invasives de la circulation sanguine et à la méningite chez lesnouveau-nés 6,7. À l’heure actuelle, il n’existe pas d’autres options de traitement que les antibiotiques et les soins de soutien. Pendant ce temps, les taux de résistance aux antibiotiques continuent d’augmenter pour de nombreuses bactéries pathogènes, certaines souches d’E. coli résistantes à une multitude d’antibiotiques couramment utilisés dans le traitement8. Ainsi, il est impératif que nous continuions à générer des méthodes pour étudier les mécanismes de la septicémie et la réponse de l’hôte chez les nouveau-nés. Ces résultats peuvent aider à améliorer les traitements actuels et les résultats de l’infection.
L’état immunitaire des nouveau-nés se caractérise à la fois par des différences phénotypiques et fonctionnelles par rapport aux adultes. Par exemple, des niveaux élevés de cytokines anti-inflammatoires et réglementaires, tels que l’interleukine (IL)-10 et l’IL-27, se sont montrés produits par des macrophages dérivés du sang de cordon ombilical et sont présents à des niveaux plus élevés dans le sérum des nouveau-nés murins9,10,11. Ceci est compatible avec les niveaux inférieurs d’IFN-α, IFN-ɣ, IL-12, et TNF-α qui sont fréquemment rapportés des cellules néonatales comparées aux pendants adultes10. En outre, le système immunitaire néonatal est biaisé vers une réponse th2 et réglementaire des cellules T par rapport aux adultes12. Un nombre élevé de neutrophiles, de lymphocytes T, de cellules B, de cellules NK et de monocytes sont également présents chez les nouveau-nés, mais avec des déficiences fonctionnelles significatives. Ceci inclut des défauts dans l’expression des marqueurs de surface de cellules et de la présentation d’antigène qui suggèrent l’immaturité13,14,15. En outre, les neutrophiles néonatals sont significativement déficients dans leur capacité à migrer vers des facteurs chemotactic16. Les cellules suppressrices dérivées des myéloïdes (MDSC) se trouvent également à des niveaux élevés chez les nouveau-nés et se sont récemment révélés être une source d’IL-2711. Les MDSC sont très suppressifs envers les cellules T17. Collectivement, ces données démontrent des limites dans l’immunité néonatale qui prêtent à la susceptibilité accrue à l’infection.
Pour étudier la progression de la charge bactérienne et disséquer les réponses immunitaires protectrices de l’hôte pendant la septicémie néonatale, nous avons développé un nouveau modèle d’infection. Les souris néonatales aux jours 3-4 de la vie sont difficiles à injecter dans l’espace intraperitoneal ou la veine de queue. Dans notre modèle, le jour 3 ou 4 chiots sont administrés l’inoculum bactérien ou PBS sous-cutanée dans la région scapulaire. Une infection systémique se développe et en utilisant luminescent E. coli O1:K1:H7, nous pouvons longitudilement image souris néonatales individuelles pour suivre la charge bactérienne disséminée dans les tissus périphériques. C’est le premier modèle rapporté à utiliser l’imagerie intravitale pour comprendre la cinétique de la dissémination des bactéries pendant la septicémie chez les nouveau-nés murins3.
Ici, nous décrivons un protocole pour induire des infections septiques d’E. coli chez les souris néonatales3. Nous décrivons comment préparer l’inoculum bactérien pour l’injection, et comment récolter le tissu pour l’évaluation de la pathologie, la mesure des marqueurs inflammatoires par l’analyse d’expression de gène, et l’énumération de la charge bactérienne. En outre, l’utilisation d’E. coli luminescent pour l’imagerie intravitale des nouveau-nés infectés et la quantification de la mise à mort bactérienne par les cellules immunitaires néonatales sont également décrites. Ces protocoles peuvent également être adaptés pour étudier d’autres infections bactériennes importantes chez les nouveau-nés. Les données présentées ici représentent une approche globale nouvelle pour comprendre la dynamique d’infection dans un modèle néonatal traduisible de septicémie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre modèle d’infection subscapulaire pour induire la septicémie bactérienne chez les souris néonatales est une nouvelle méthode pour étudier la propagation longitudinale des pathogènes bactériens en temps réel. L’imagerie intravitale offre l’occasion d’explorer la dissémination bactérienne en temps réel chez les nouveau-nés. Ceci est essentiel pour comprendre la cinétique de la dissémination bactérienne et pour étudier plus avant la réponse de l’hôte et les dommages à la phase appropriée …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été appuyés par des fonds institutionnels .M C.R.
Materials
| 1 mL Insulin Syringe | Coviden | 1188128012 | Inoculum or PBS injection |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370-094 | Histopathology |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | LSA1049201 | Bacterial clearance assay |
| Animal Tattoo Ink Paste | Ketchum | KI1482039 | Animal identification |
| Animal Tattoo Ink Green Paste | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
| Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) | N/A | N/A | Constructed in-house at WVU |
| E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
| IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
| IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
| LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
| EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
| SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
| Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
| Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
| TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |
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