Summary

Funktionelle Isolierung von einzelnen Motoreinheiten von Ratte Medial Gastrocnemius Muskel

Published: December 26, 2020
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Summary

Diese Methode ermöglicht die Aufzeichnung der Kraft von zuckenden und tetanischen Kontraktionen und Aktionspotentialen in drei Arten von Motoreinheiten im ratmedialen Gastrocnemius-Muskel. Die funktionelle Isolierung einer einzelnen Motoreinheit wird durch elektrische Stimulation des Axons induziert.

Abstract

Diese Arbeit skizziert die funktionelle Isolierung von Motoreinheiten (MUs), eine standardelektrophysiologische Methode zur Bestimmung der Eigenschaften von Motoreinheiten in hinteren Muskeln (wie mediale Gastrocnemius, Soleus oder Plantaris-Muskel) bei experimentellen Ratten. Ein entscheidendes Element des Verfahrens ist die Anwendung elektrischer Reize, die an ein motorisches Axon geliefert werden, das von der ventralen Wurzel isoliert ist. Die Reize können in konstanten oder variablen Interpulsintervallen abgegeben werden. Diese Methode eignet sich für Versuche an Tieren in unterschiedlichen Reifestadien (jung, erwachsen oder alt). Darüber hinaus kann dieses Protokoll in Experimenten zur Untersuchung der Variabilität und Plastizität von Motoreinheiten verwendet werden, die durch ein breites Spektrum von Interventionen hervorgerufen werden. Die Ergebnisse dieser Experimente können sowohl das Grundwissen in der Muskelphysiologie erweitern als auch in praktische Anwendungen umgesetzt werden. Dieses Verfahren konzentriert sich auf die chirurgische Vorbereitung für die Aufzeichnung und Stimulation von MUs, wobei der Schwerpunkt auf den notwendigen Schritten zur Erreichung der Präparationsstabilität und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse liegt.

Introduction

Motoreinheiten (MUs) sind die kleinsten funktionellen Einheiten der Skelettmuskulatur. Daher ist das Verständnis ihrer Funktion, Plastizität und kontraktilen Eigenschaften sowie der Mechanismen ihrer Kraftregulierung entscheidend für den Fortschritt in der Muskelphysiologie. Die grundlegenden kontraktilen Eigenschaften von MUs und die Proportionen ihrer physiologischen Typen wurden für zahlreiche Muskeln dokumentiert, vor allem die Hinterbeinermuskeln bei Versuchstieren. Sowohl die Plastizität der MU-Eigenschaften als auch die Mechanismen der MU-Kraftregulierung sind jedoch noch nicht vollständig verstanden.

Das Prinzip der beschriebenen Methode ist eine umfangreiche Denervation der Hinterkiefermuskulatur mit Ausnahme der untersuchten und der Laminektomie an den Lendenwirbeln, um dünne ventrale Wurzeln vorzubereiten, die jeweils ein einzelnes “funktionelles” Motoraxon enthalten, das elektrisch stimuliert wird, um die Kraft und das Einwirkungspotenzial des MU aufzuzeichnen. Mit der in diesem Papier beschriebenen Technik ist es möglich, mehr als die Hälfte der MUs des medialen Magen-Darm-Muskels in einem erfolgreichen Experiment zu isolieren. Die Ratte medial gastrocnemius besteht im Durchschnitt aus 52 MUs (Frauen) oder 57 MUs (Männchen) von drei physiologischen Typen: S (langsam), FR (schnell resistent) und FF (schnell fettbar)1,2, und haben variable kontraktile Eigenschaften3. Für Experimente zum Vergleich von Mittelwerten für MUs in den Kontroll- und Versuchsgruppen sind Isolierung und Aufzeichnung von 10-30 MUs für jede dieser Gruppen erforderlich. Kritisch ist, dass einzelne MUs für Zeiträume von mehr als einer Stunde zur Stimulation zugänglich sein können. Da diese Technik es ermöglicht, sowohl MU-Kraft- als auch Aktionspotentiale zu erfassen, eignet sich diese Methode für die Untersuchung von Phänomenen im Zusammenhang mit der Kraftproduktion, die Bewertung der Auswirkungen von Ermüdung und die Beobachtung der Beziehung zwischen Kraft- und Aktionspotentialen.

Frühere Studien haben bestätigt, dass MU-Kontraktile Eigenschaften aus Kunststoff sind und durch zahlreiche Interventionen moduliert werden können. Experimente mit der hier beschriebenen Technik wurden an ratmedialen Gastrocnemius4 oder anderen Hinterbaltmuskeln der Ratte5,6 sowie an den Katzenmuskeln7mit einer ähnlichen Methode der Single-MU-Isolierung durchgeführt. Eine weitere Versuchsreihe mit Stimuli-Zügen, die in variablen Interpulsintervallen durchgeführt wurden, lieferte Beobachtungen zu motorischen Steuerungsprozessen, und die Ergebnisse lenken im Allgemeinen die Aufmerksamkeit auf die Geschichte der Stimulation, einschließlich erheblicher Auswirkungen einer Verschiebung der Zeitskala sogar eines Stimulus, der für die Kraftproduktion8,9entscheidend ist.

MUs können auch mit alternativen Methoden untersucht werden. Erstens ist eine Methode die direkte Stimulation von Motoneuronen. Burke verwendete intrazelluläre Stimulation von Motoneuronen in Cat medial gastrocnemius und Soleus mit Glasmikroelektroden, die parallel verwendet werden, um die elektrophysiologischen Eigenschaften dieser Neuronen1,10zu bestimmen. Andere Methoden wurden vorgeschlagen, um MUs in menschlichen Muskeln zu untersuchen, die eine erheblich geringere Intervention erfordern. Bei all diesen Methoden werden die Stimulierungs- und Aufnahmeelektroden in den Muskel oder Nerv eingeführt und Kraft vom Finger oder vom Fuß aufgezeichnet. Die erste dieser Methoden wurde verwendet, um MUs in der ersten dorsalen interossischen Muskel zu studieren. Für diesen Muskel, der sich mit einer niedrigen Kraft kontrahiert, wurden im Elektromyogramm, das mit der in den Muskel eingesetzten Nadelelektrode aufgezeichnet wurde, die Wirkungspotentiale von nur einer aktiven Motoreinheit identifiziert. Dann wurden die Fragmente einer Muskelkraft, die parallel und nach jeder Aktion aufgezeichnet wurden, gemittelt (spike-triggered averaging). Diese Methode ermöglicht die Extraktion der Kraft einer Motoreinheit aus der Muskelkraftaufzeichnung11. Die methodische Schwäche dieses Verfahrens besteht jedoch darin, dass keine einzelne Zuckkraft, sondern Fragmente von tetanischen Kontraktionen gemittelt wurden. Human MUs können auch mit der zweiten Methode der intramuskulären elektrischen Mikrostimulation mit einer Elektrode in den Muskel12eingeführt untersucht werden, die ein Fragment eines Axonbaums stimuliert, was zur Aktivierung einer einzigen Motoreinheit führt. Die dritte Methode ist die Mikrostimulation mit einer In den Nerv eingeführten Elektrode. Wenn die Elektrode nur ein Motoraxon im Nerv aktiviert, ist nur eine Motoreinheit13angeschlagen. Diese letzten Methoden haben einige Einschränkungen, einschließlich Stabilität und Qualität der Aufzeichnung, ethische Einschränkungen und Zugang zum experimentellen Material. Dieses Protokoll wurde ausgiebig bei Katzen in den 70er und 80erJahren 14verwendet.

Protocol

Alle Verfahren müssen von der lokalen Ethikkommission genehmigt werden und sich an die Leitlinien der Europäischen Union zur Tierpflege sowie an das nationale Tierschutzgesetz halten. HINWEIS: Jeder Experimentator, der an diesem Verfahren beteiligt ist, muss in grundlegenden chirurgischen Verfahren geschult werden und eine gültige Lizenz für die Durchführung von Tierversuchen erhalten. 1. Anästhesie Anästhetisieren Sie die Ratte mit einer intraperit…

Representative Results

Parameter von Motoreinheitenkontraktionen und Aktionspotentialen können auf der Grundlage von Aufzeichnungen berechnet werden, wenn stabile Bedingungen der Aufnahmen gewährleistet sind. Abbildung 1 zeigt eine repräsentative Aufzeichnung des einzelnen Zuckens eines schnellen MU. Die obere Spur zeigt das Wirkungspotenzial der Motoreinheit. Die Verzögerung zwischen der Reizabgabe und dem Beginn des Wirkungspotenzials der Motoreinheit ist auf die Leitungszeit von der ventralen Wurzel bis zum…

Discussion

Bei korrekter Arbeit erfahrener Wissenschaftler sollte die chirurgische Komponente des beschriebenen Protokolls innerhalb von etwa zwei Stunden abgeschlossen sein. Besonders darauf sollte geachtet werden, dass das Tier während der Operation stabile physiologische Bedingungen aufrechterhält, insbesondere die Körpertemperatur und die Tiefe der Anästhesie, die systematisch durch die Beurteilung von Pinna- und Entzugsreflexen kontrolliert werden sollten. Nach der Operation sollte es möglich sein, stabile Aufnahmebedingu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch das Stipendium des Polnischen Nationalen Forschungszentrums 2018/31/B/NZ7/01028 unterstützt.

Materials

Force transducer custom-made
Forceps Fine Science Tools No. 11255-20 Dumont #55 with extra light and fine shanks
Forceps Fine Science Tools No. 11150-10 Extra Fine Greafe Forceps
Forceps Fine Science Tools No. 11026-15 Special cupped pattern for superior grip
Forceps Fine Science Tools No. 11023-10 Slim 1×2 teeth
Forceps Fine Science Tools No. 11251-20 Dumont #5
Hemostats Fine Science Tools No. 13003-10 Hartman
Isolation Unit Grass Instruments S1U5A
Low Noise Bioamplifer World Precision Instruments Order code 74030
Needle holders Fine Science Tools No. 12503-15 With tungsten carbide jaws
Rongeurs Fine Science Tools No. 16021-14 Friedman-Pearson
Scissors Fine Science Tools No. 14101-14 Straight sharp/blunt with large finger loops
Scissors Fine Science Tools No. 14075-11 Curved blunt/blunt
Scissors Fine Science Tools No. 14084-08 Extra fine bonn
Scissors Fine Science Tools No. 15000-00 Straight, ideal for cutting nerves
Stimulator Grass Instruments S88 Dual Output Square Pulse Stimulator

References

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Drzymała-Celichowska, H., Celichowski, J. Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle. J. Vis. Exp. (166), e61614, doi:10.3791/61614 (2020).

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