In Vitro Kulturstrategie für Oozyten aus dem frühen Antralfollikel bei Rindern

Summary

Wir beschreiben die Verfahren zur Isolierung wachsender Eizellen von Eierstockfollikel in frühen Entwicklungsstadien sowie den Aufbau eines In-vitro-Kultursystems, das das Wachstum und die Differenzierung bis in die ausgewachsene Phase unterstützen kann.

Abstract

Die begrenzte Reserve an reifen, befruchtbaren Eizellen stellt ein großes Hindernis für den Erfolg der assistierten Fortpflanzung bei Säugetieren dar. Wenn man bedenkt, dass während der Fortpflanzungszeit nur etwa 1% der Eizellen in einem Eierstock reifen und Eizellen entwickelt wurden, wurden mehrere Techniken entwickelt, um die Ausbeutung der Eierstockreserve für die wachsende Bevölkerung von nicht-ovulatorischen Follikel zu erhöhen. Solche Technologien haben Eingriffe in die Fruchtbarkeitserhaltung, Selektionsprogramme in Nutztieren und die Erhaltung gefährdeter Arten ermöglicht. Das enorme Potenzial der Eierstockreserve ist jedoch noch weitgehend ungenutzt. Bei Kühen wurden beispielsweise einige Versuche unternommen, die In-vitro-Kultur der Eizellen in bestimmten Entwicklungsstadien zu unterstützen, aber es wurden noch keine effizienten und zuverlässigen Protokolle entwickelt. Hier beschreiben wir ein Kultursystem, das die physiologischen Bedingungen des entsprechenden Follikelstadiums reproduziert, definiert, um in vitro wachsende Eizellen zu entwickeln, die aus rinderfrühen Antralenfollikel gesammelt werden, bis zum ausgewachsenen Stadium, das dem medium antralen Follikel in vivo entspricht. Eine Kombination von Hormonen und einem Phosphodiesterase-3-Hemmer wurde verwendet, um eine vorzeitige meiotische Wiederaufnahme zu verhindern und die Differenzierung der Oozyten zu steuern.

Introduction

Während der Fortpflanzungsdauer wird nur ein minimaler Bruchteil der Eizellen, die in einem Eierstock reifen, in den Eileitern nach dem Eisprung freigesetzt und zur Befruchtung zur Verfügung gestellt und zu einem lebensfähigen Embryo¹entwickelt. Auf der anderen Seite, die meisten der Eizellen innerhalb eines Eierstocks unterziehen Atresie und werden nie eigewellt. In-vitro-Embryoproduktion (IVP) Technologien haben versucht, die Ausbeutung der Eierstockreserve zu erhöhen^2,3. Bisher haben solche Technologien Eingriffe in die Fruchtbarkeitserhaltung, Selektionsprogramme bei Nutztieren und die Erhaltung gefährdeter Arten ermöglicht. Dennoch verwenden die meisten Protokolle Eizellen, die im Grunde die Wachstumsphase innerhalb des antralen Ovarialfollikels abgeschlossen haben, und werden daher als ausgewachsene Eizellen bezeichnet. Bei Rindern, bei denen IVP-Technologien weit verbreitet sind, erreichen ausgewachsene Eizellen einen Enddurchmesser von ca. 120 m und werden aus Follikel mit einem Durchmesser von 2 bis 8 mm (mittlere Antraline)¹gesammelt. Nach Isolierung von den Follikel werden solche Eizellen in vitro gereift und befruchtet. Die Zygoten werden dann bis zum Blastozystenstadium kultiviert und entweder in einen Empfänger übertragen oder kryokonserviert. Bei Rindern wie auch bei vielen anderen Arten hat sich die Zahl der in vitro produzierten Embryonen pro Kuh in den letzten 40 Jahren trotz des Potenzials von IVP nicht wesentlich verbessert. Dies ist zum Teil auf die begrenzte Anzahl ausgewachsener Eizellen zurückzuführen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt einen Eierstock bevölkern, der abgerufen und den Standard-IVP-Techniken^4,5,6unterzogen werden kann.

Die in frühen Antradenfollikel eingeschlossenen Eizellen, d.h. die Follikel mit einem Durchmesser von weniger als 2 mm, stellen eine potentielle Quelle dar, die in Fruchtbarkeitserhaltungsprogrammen⁷ verwendet werden kann, da ein Eierstock etwa 10-mal mehr frühe Anralfollikel enthält als mittlere Antral8 .⁸ Diese Eizellen befinden sich jedoch noch in der Wachstumsphase und haben noch nicht die ausgewachsene Stufe⁹erreicht. Als solche sind sie immer noch transkriptional aktiv, produzieren mRNAs, die für spätere Entwicklungsschritte gespeichert werden, und haben noch nicht alle Differenzierungsprozess erforderlich, um die Eizellen mit der Fähigkeit der spontanen Wiederaufnahme und Vervollständigung der Meiose ich einmal isoliert aus dem Follikulärfach^10,11. Daher können sie nicht direkt den Standard-In-vitro-Reifungsprotokollen (IVM) unterzogen werden, aber sie erfordern eine zusätzliche Kulturperiode, die es ihnen ermöglichen würde, die Wachstumsphase abzuschließen und richtig zu differenzieren.

Der Übergang vom Anbau zum ausgewachsenen Stadium, der bei Rindern auftritt, wenn sich der Follikel vom frühen Antrale zum mittleren antralen Stadium entwickelt, ist einer der kritischen Schritte während der Eizellenentwicklung. Bei Rindern versuchten mehrere Studien, diese Ereignisse in vitro^{2,12,13,14,15,16,17,18,19}zu rekapitulieren. Bisher wurden jedoch keine zuverlässigen Protokolle entwickelt und nur begrenzter Erfolg gemeldet. Nach früheren Studien²⁰bilden diese wachsenden Eizellen eine homogene Population. Neben der Transkriptionsaktivität wird ihr Chromatin im Keimbläschen (GV) in einer Konfiguration mit dem Namen GV0^2,21verteilt. Umgekehrt ist die Population ausgewachsener Eizellen, die aus mittleren Antralenfolliken gewonnen werden, heterogener, ein Zustand, der sich in den verschiedenen Graden der Chromatinverdichtung (GV1, GV2 und GV3) widerspiegelt, die beobachtet werden können²⁰. Unter diesen haben frühere Daten gezeigt, dass GV2 und GV3 Oozyten insgesamt durch eine bessere Qualität und höhere embryonale Entwicklungskompetenz gekennzeichnet sind^{20,21,22,23,24}.

Ausgehend von den obigen Beobachtungen beschreiben wir hier ein 5 Tage langes Kultursystem von Eizellen (L-IVCO), das die Differenzierung von Eizellen ermöglicht, die als Cumulus-Oozytenkomplexe (COCs) von frühen antralen Follikel isoliert sind. Diese Kulturstrategie hat sich aus 10 Jahren langen Studien in unserem Labor entwickelt und wurzelt ihren Grund auf der zuvor entwickelten 24-48 Stunden In-vitro-Oozytenkultur (IVCO)², Prämaturationssysteme^23,25 und Zink-Supplementierung während der Oozytenkultur . Eine Kombination aus Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) und einem Phosphodiesterase-3 (PDE3)-Hemmer, der in der Lage ist, die Cumulus-Oozyten-Kommunikation zu verbessern², eine vorzeitige meiotische Wiederaufnahme zu verhindern², und das Oozytenwachstum² zu unterstützen, wurde verwendet.

Protocol

Eierstöcke wurden von 4 bis 8 Jahre alten Holsteiner Milchkühen gesammelt, die im örtlichen Schlachthof geborgen wurden (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italien). 1. Medienvorbereitung HINWEIS: Alle Medien müssen mindestens vier Stunden vor Gebrauch vorbereitet werden. Natriumbicarbonat-gepufferte Medien werden bei 38,5 °C und 5%CO2 in der Luft, maximale Luftfeuchtigkeit, inkubiert. HEPES-gepufferte Medien werden im Thermostatofe…

Representative Results

Am Ende des L-IVCO änderte sich die Bruttomorphologie der COCs und 4 Klassen wurden anhand des Aussehens der Cumuluszellen identifiziert, wie in Abbildung 2dargestellt. Basierend auf den morphologischen Kriterien, die üblicherweise zur Auswahl gesunder COCs11,26,27, der Klasse 1, 2 und 3 gewählt wurden, wurden die Klasse 4, die deutliche Anzeichen einer Degeneration wie das Fehlen vollständiger …

Discussion

Hier beschreiben wir ein Kultursystem für wachsende Eizellen, das die Eizellenentwicklung für 5 Tage fördert, indem es ihre Lebensfähigkeit unterstützt und die meiotische Wiederaufnahme verhindert. Dieser letztgenannte Aspekt ist von größter Bedeutung, um das kontinuierliche Wachstum und die Differenzierung zu ermöglichen, die notwendig sind, um die Eizelle mit meiotischer und embryonaler Entwicklungskompetenz^2,20zu verleihen, die andernfalls durch eine v…

Materials

4-well dishes	Nunclon	179830
96-well dish	Becton Dickinson Biosciences	356649	BioCoat™ Collagen I
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)	Sigma	A8806
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Sigma	A3311
Cell culture water	Sigma	W3500
Cilostamide	Sigma	C7971
Cysteamine	Sigma	M9768
Digital camera	Nikon Corp	Camera DS-5M
Disodium phosphate	Sigma	S5136
Estradiol	Sigma	E2758
Glutamax Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
Gonal F	Merck Serono
Heparin	Sigma	H3149
Hepes	Sigma	H3784
Vacuum pump	Cook-IVF
Incubator	Sanyo
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus	Sigma	K1377
Medium 199	Sigma	M3769	Powder for hepes-buffered TCM199
Medium 199	Sigma	M2520	Powder for M199-D
Microscope	Nikon Corp	Nikon Diaphot
Microscope	Nikon Corp	Eclipse E 600
Monopotassium phosphate	Sigma	P5655
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicilin	Sigma	P3032
Phenol Red	Sigma	P5530
Polyvinyl alcohol	Sigma	P8137
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	P5288	360k molecular weight
Potassium chloride	Sigma	P5405
Progesterone	Sigma	P8783
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium choride	Sigma	P5886
Sodium pyruvate	Sigma	P4562
Streptomycin	Sigma	S9137
Testosterone	Sigma	86500
Triton X	Sigma	T9284
Vectashield with DAPI	Vector Laboratories	H1200
Water	Sigma	W3500
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	Z0251