In Vitro Kultur Strategi for Oocytes fra Tidlig Antral Follikkel i Storfe

Summary

Vi beskriver prosedyrene for isolering av voksende oocytter fra ovariefollikler i tidlige utviklingsstadier, samt oppsettet av et in vitro kultursystem som kan støtte vekst og differensiering opp til det fullvoksne stadiet.

Abstract

Den begrensede reserven av modne, befruktbare oocytter representerer en stor barriere for suksessen til assistert reproduksjon hos pattedyr. Tatt i forhold til at i løpet av reproduktiv levetid bare ca 1% av oocytes i en eggstokk modne og eggløsning, flere teknikker har blitt utviklet for å øke utnyttelsen av ovarian reserve til den voksende befolkningen av ikke-ovulatory follikler. Slike teknologier har tillatt intervensjoner av fruktbarhet bevaring, utvalg programmer i husdyr, og bevaring av truede arter. Imidlertid er det enorme potensialet i ovariereserven fortsatt i stor grad uutnyttet. Hos kyr, for eksempel, noen forsøk har blitt gjort for å støtte in vitro kultur av oocytes på bestemte utviklingsstadier, men effektive og pålitelige protokoller har ennå ikke blitt utviklet. Her beskriver vi et kultursystem som reproduserer de fysiologiske forholdene i det tilsvarende follikulære stadiet, definert for å utvikle in vitro voksende oocytter samlet fra storfe tidlig antrale follikler til det fullvoksne stadiet, tilsvarende den middels antral follikkel in vivo. En kombinasjon av hormoner og en fosfodiesterase 3-hemmer ble brukt til å forhindre tidlig meiotisk gjenopptakelse og for å veilede oocytes differensiering.

Introduction

I løpet av den reproduktive levetiden frigjøres bare en minimal brøkdel av oocytter som er tilstede i eggstokken, i egglederne ved eggløsning, og er tilgjengelige for å bli befruktet og utvikle seg til et levedyktig embryo¹. På den annen side gjennomgår de fleste oocytes i en eggstokk atresi og blir aldri eggløsning. In vitro embryoproduksjon (IVP) teknologier har forsøkt å øke utnyttelsen av ovarian reserve^2,3. Så langt har slike teknologier tillatt intervensjoner av fruktbarhet bevaring, utvalg programmer i husdyr, og bevaring av truede arter. Likevel bruker de fleste protokoller oocytes som i utgangspunktet har fullført vekstfasen i antral ovariefollikelen, og dermed kalles fullvoksne oocytter. I storfe, hvor IVP-teknologier er mye brukt, når fullvoksne oocytter en endelig diameter på ca. 120 μm og samles inn fra follikler som strekker seg fra 2 til 8 mm i diameter (middels antral follikler)¹. Ved isolasjon fra folliklene blir slike oocytter in vitro modnet og befruktet. Zygotene blir deretter dyrket opp til blastocyst scenen og enten overført til en mottaker eller kryopreservert. Hos storfe, så vel som i mange andre arter, til tross for potensialet som tilbys av IVP, ble antall in vitro produsert embryo per ku ikke i stor grad bedre de siste 40 årene. Dette skyldes delvis det begrensede antallet fullvoksne oocytter som fyller en eggstokk på et gitt tidspunkt som kan hentes og utsettes for standard IVP^{teknikker 4,5,6}.

Oocytes omsluttet i tidlig antral follikler, det vil si de folliklene som er mindre enn 2 mm i diameter, representerer en potensiell kilde som skal brukes i fruktbarhet bevaring programmer⁷ , som en eggstokk omtrent inneholder 10 ganger mer tidlig antral follikler enn middels antral⁸. Imidlertid er disse oocytes fortsatt i vekstfasen og har ennå ikke nådd den fullvoksne scenen⁹. Som sådan er de fortsatt transkripsjonelt aktive, produserer mRNAs som vil bli lagret for senere utviklingstrinn, og har ennå ikke gjennomgått all differensieringsprosessen som kreves for å overdra oocytter med evnen til spontant å gjenoppta og fullføre meiose jeg en gang isolert fra follikulært^{rom 10,11}. Derfor kan de ikke sendes direkte til standard IN vitro modningsprotokoller (IVM), men de krever en ekstra periode med kultur som ville tillate dem å fullføre vekstfasen og skille riktig.

Overgangen fra den voksende til det fullvoksne scenen, som hos storfe oppstår når follikkelen utvikler seg fra tidlig antral til middels antralstadium, er et av de kritiske trinnene under oocyteutvikling. I storfe, flere studier forsøkte å rekafulere disse hendelsene in vitro^{2,12,13,14,15,16,17,18,19}. Men til dags dato ingen pålitelige protokoller har blitt utviklet og bare begrenset suksess har blitt rapportert. Ifølge tidligere studier²⁰utgjør disse voksende oocytes en homogen befolkning. Foruten å være transkripsjonelt aktiv, er deres kromatin spredt i germinal vesikkelen (GV), i en konfigurasjon som heter GV0^2,21. Omvendt er befolkningen av fullvoksne oocytter hentet fra middels antrale follikler mer heterogen, en tilstand som speiles av de ulike gradene av kromatinkomprimering (GV1, GV2 og GV3) som kan observeres²⁰. Blant disse har tidligere data vist at GV2 og GV3 oocytes er samlet preget av en bedre kvalitet og høyere embryonisk utviklingskompetanse^{20,,21,,22,,23,,24}.

Fra de ovennevnte observasjonene beskriver vi her et 5-dagers langt kultursystem av oocytter (L-IVCO) som tillater differensiering av oocytter isolert som cumulus-oocyte komplekser (COCer) fra tidlige antral follikler. Denne kulturstrategien har utviklet seg fra 10 år lange studier utført i vårt laboratorium og røtter sin grunn på den tidligere utviklede 24-48 timer in vitro oocyte kultur (IVCO)^2,premetningssystemer^23,,25 og sink tilskudd under oocyte kultur . En kombinasjon av follikkelstimulerende hormon (FSH) og en fosfodiesterase-3 (PDE3) hemmer, i stand til å forbedre cumulus-oocyte^{kommunikasjon 2}, hindre tidlig meiotisk gjenopptakelse², og støtte oocyte vekst² ble brukt.

Protocol

Eggstokkene ble samlet inn fra 4 til 8 år gamle Holstein melkekyr gjenvunnet ved det lokale slakteriet (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italia). 1. Forberedelse av medier MERK: Alle medier må være forberedt minst fire timer før bruk. Natriumbikarbonatbufret media inkuberes ved 38,5 °C og 5 % CO2 i luft, maksimal luftfuktighet. HEPES-bufret media opprettholdes ved 38,5 °C i termostatovn. Lang in vitro kultur av oocyte…

Representative Results

På slutten av L-IVCO ble bruttomorfologien til COCene endret og 4 klasser ble identifisert basert på utseendet til cumulus-cellene, som vist i figur 2. Basert på de morfologiske kriteriene som vanligvis ble vedtatt for å velge sunne COCer11,26,27,ble klasse 1, 2 og 3 dømt sunn, mens klasse 4, som viste klare tegn på degenerasjon som fravær av komplette lag av cumulus celler rundt oocytes, ble…

Discussion

Her beskriver vi et kultursystem for voksende oocytter som fremmer oocyteutvikling i 5 dager ved å støtte deres levedyktighet og forhindre meiotisk gjenopptakelse. Dette siste aspektet er av største betydning for å tillate fortsatt vekst og differensiering som er nødvendig for å overdra oocytten med meiotisk og embryonisk utviklingskompetanse^2,20, som ellers ville bli blokkert av en for tidlig gjenopptakelse av den meiotiske divisjonen.

<p class="jove_c…

Materials

4-well dishes	Nunclon	179830
96-well dish	Becton Dickinson Biosciences	356649	BioCoat™ Collagen I
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free)	Sigma	A8806
Bovine Serum Albumin (Fraction V)	Sigma	A3311
Cell culture water	Sigma	W3500
Cilostamide	Sigma	C7971
Cysteamine	Sigma	M9768
Digital camera	Nikon Corp	Camera DS-5M
Disodium phosphate	Sigma	S5136
Estradiol	Sigma	E2758
Glutamax Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
Gonal F	Merck Serono
Heparin	Sigma	H3149
Hepes	Sigma	H3784
Vacuum pump	Cook-IVF
Incubator	Sanyo
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus	Sigma	K1377
Medium 199	Sigma	M3769	Powder for hepes-buffered TCM199
Medium 199	Sigma	M2520	Powder for M199-D
Microscope	Nikon Corp	Nikon Diaphot
Microscope	Nikon Corp	Eclipse E 600
Monopotassium phosphate	Sigma	P5655
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicilin	Sigma	P3032
Phenol Red	Sigma	P5530
Polyvinyl alcohol	Sigma	P8137
Polyvinylpyrrolidone	Sigma	P5288	360k molecular weight
Potassium chloride	Sigma	P5405
Progesterone	Sigma	P8783
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium choride	Sigma	P5886
Sodium pyruvate	Sigma	P4562
Streptomycin	Sigma	S9137
Testosterone	Sigma	86500
Triton X	Sigma	T9284
Vectashield with DAPI	Vector Laboratories	H1200
Water	Sigma	W3500
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	Z0251