Lipidico-injektionsprotokol til seriel krystallografimålinger ved den australske synkrotron

Summary

Målet med denne protokol er at demonstrere, hvordan man forbereder serielle krystallografiprøver til dataindsamling på en høj tyktflydende injektor, Lipidico, der for nylig blev bestilt på den australske synkrotron.

Abstract

En facilitet til udførelse af serielle krystallografi målinger er blevet udviklet på den australske synkrotron. Denne facilitet indeholder et formål bygget høj tyktflydende injektor, Lipidico, som en del af makromolekylær krystallografi (MX2) strålelinje til at måle et stort antal små krystaller ved stuetemperatur. Formålet med denne teknik er at gøre det muligt at dyrke/overføre krystaller til glassprøjter direkte i injektoren til indsamling af serielle krystallografidata. Fordelene ved denne injektor omfatter evnen til at reagere hurtigt på ændringer i strømningshastigheden uden afbrydelse af strømmen. Der findes flere begrænsninger for denne injektor med høj viskositet (HVI), som omfatter en begrænsning af de tilladte prøveviskositeter til >10 Pa.s. Streamstabilitet kan også potentielt være et problem afhængigt af prøvens specifikke egenskaber. En detaljeret protokol for, hvordan man opsætter prøver og betjener injektoren til serielle krystallografimålinger ved den australske synkrotron, præsenteres her. Metoden demonstrerer forberedelse af prøven, herunder overførsel af lysozymkrystaller til et højkøst medie (silikonefedt) og injektorens funktion til dataindsamling hos MX2.

Introduction

Seriel krystallografi (SX) er en teknik, der oprindeligt blev udviklet i forbindelse med røntgenfri elektronlasere (XFELs)^1,2,3,4. Selvom faste måltilgange kan bruges til SX^5,6,7, anvendes injektorsystemer typisk til at levere krystaller i en kontinuerlig strøm til røntgenstrålen. Da SX kombinerer data fra et stort antal krystaller, undgår det behovet for krystaljustering under eksperimentet og gør det muligt at indsamle data ved stuetemperatur^8,9. Ved hjælp af en passende injektor streames krystallerne en efter en ind i røntgeninteraktionsområdet, og de resulterende diffraktionsdata indsamles på en områdedetektor^9,10. Til dato har SX haft succes med at løse en række proteinstrukturer¹,^11,12,13 inklusive krystaller for små til at måle ved hjælp af konventionel krystallografi. Det har også givet ny indsigt i tidsløst molekylær dynamik ved at udnytte XFEL’s femtosekunds pulsvarighed. Ved at indlede pumpe-sonde reaktioner med optiske laserkilder, dybdegående undersøgelser er blevet udført på fotosystem II^14,15, fotoaktiv gult protein^16,17, cytochrom C oxidase¹⁸, samt bacteriorhodopsin^19,20,21. Disse undersøgelser har undersøgt den elektronoverførselsdynamik, der opstår efter lysaktivering, hvilket viser det betydelige potentiale i seriel krystallografi til forståelse af tidsløste biologiske processer.

Udviklingen af seriel krystallografi bliver også mere og mere udbredt ved synkrotronkilder^{9,12,20,22,23,24}. Synkrotronbaseret SX gør det muligt at måle et stort antal individuelle krystaller effektivt ved stuetemperatur ved hjælp af et passende injektorsystem. Denne tilgang er velegnet til mindre krystaller, og ud over at kræve en hurtig billedhastighedsdetektor til at indsamle dataene kræves der også en mikrofokuseret stråle. Sammenlignet med konventionel krystallografi involverer SX ikke montering og justering af individuelle krystaller i røntgenstrålen. Da data fra et stort antal individuelle krystaller flettes sammen, kan den strålingsdosis, som hver krystal har modtaget, reduceres betydeligt sammenlignet med konventionel krystallografi. Synkrotron SX kan også anvendes til undersøgelse af tidsløste reaktioner, selv ned til millisekundregimet, forudsat at en detektor med en tilstrækkelig høj billedhastighed er tilgængelig (f.eks. 100 Hz eller mere). Flere serielle krystallografi eksperimenter er blevet udført på synkrotronen ved hjælp af injektorer, der oprindeligt blev udviklet på XFEL kilder^20,22,23. De to mest almindelige typer injektorer er Gas Dynamic Virtual Nozzle (GDVN)²⁵ og High Viscous Injector (HVI)^{9,24,26,27,28}. GDVN er ideel til injektion af lav viskositet, flydende prøver, men kræver høje strømningshastigheder for at opnå stabile vandløb, hvilket igen fører til høje prøveforbrugshastigheder. Derimod er HVI’er velegnede til prøver med høj viskositet, som gør det muligt at frembringe en stabil strøm ved meget lavere strømningshastigheder, hvilket fører til et meget lavere prøveforbrug. HVI-injektoren favoriserer derfor levering af prøver, hvor en tyktflydende bærer er at foretrække (f.eks. lipidbaseret for membranproteiner) og/eller store mængder prøve er ikke tilgængelige. SX-injektorer er generelt udfordrende at bruge og kræver omfattende træning for at fungere. De omfatter også lange prøveoverførselsprotokoller, da prøven skal indlæses i et specialiseret reservoir, har dette generelt en høj risiko forbundet med, at prøven går tabt enten i det “døde volumen” eller via lækager i forbindelserne. Det er derfor ønskeligt at optimere injektordesignet for at afbøde eventuelle tab, før prøven når røntgenstrålen.

For nylig blev de første SX-resultater offentliggjort ved hjælp af Lipidico²³ med et lysozymmål ved hjælp af en Eiger 16M-detektor. Dette injektordesign begrænser prøvespildet ved at minimere antallet af trin, der er involveret i at gå fra indledende krystallisering til overførsel af krystaller til injektoren efterfulgt af levering af prøve til røntgenstrålen. Dette manuskript beskriver og demonstrerer prøveoverførselsproceduren fra prøveforberedelse, overgang til injektionsprocessen og endelig dataindsamling ved hjælp af det samme krystalliseringsbeholder. Injektorens funktion er også beskrevet.

Protocol

1. Fremstilling af krystaller i et højkøst medie ved hjælp af glassprøjter Krystalopløsningen centrifugeres forsigtigt (~1.000 x g, ~10 min ved 22 °C) for at danne en blød krystalpellet og fjerne den overskydende buffer. Dette vil resultere i en høj koncentration af krystaller i pellet, som kan bruges til dataindsamling.BEMÆRK: For at forhindre fortynding af det tyktflydende medie øges krystalkoncentrationen på dette trin. Optimer forholdet mellem tyktflydende medier og krystalvolumen fo…

Representative Results

Lipidico er en HVI bygget som et alternativt leveringssystem til brug på MX2 (Figur 1). Den er ideel til SX, hvor krystaller enten dyrkes i lipidisk kubisk fase eller overføres til et højt tyktflydende inert medie. For at demonstrere injektorapplikationen blev silikonefedt blandet med lysozymkrystaller brugt til at indsamle SX-data ved MX2-strålelinjen ved den australske synkrotron. For at montere injektoren på MX2-strålelinjen fjernes den kryogene dyse og e…

Discussion

Der er udviklet en alternativ HVI, som er ideel til udførelse af SX-eksperimenter ved synkrotronkilder. Det har to vigtige fordele i forhold til eksisterende HVIs. For det første er det nemt at installere på beamline giver mulighed for hurtig skift mellem konventionelle krystallografi og SX, bare ~ 30 minutter er påkrævet for installation og justering på MX2. For det andet kan de prøvesprøjter, der bruges til at dyrke krystaller, bruges direkte som reservoirer til injektion, hvilket begrænser spild under prøveo…

Materials

Hen eggwhite lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876	Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/
High vacuum silicon grease	Dow Corning	Z273554-1EA	Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/
Injector needle (108 µm ID)	Hamilton	part No: 7803-05	www.hamiltoncompany.com
Glass gas-tight syringes, 100 µl	Hamilton	part no: 7656-01	Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com
LCP syringe coupler	Formulatrix	209526	Syringe coupler to mix the samples
Lipidico injector	La Trobe Univerity/ANSTO		This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility