Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie serielle Kristallographieproben für die Datenerfassung auf einem hochviskosen Injektor, Lipidico, vorbereitet werden, das kürzlich im australischen Synchrotron in Auftrag gegeben wurde.
Am australischen Synchrotron wurde eine Anlage zur Durchführung serieller Kristallographiemessungen entwickelt. Diese Anlage verfügt über einen speziell gebauten hochviskosen Injektor, Lipidico, als Teil der makromolekularen Kristallographie (MX2) Strahllinie, um eine große Anzahl von kleinen Kristallen bei Raumtemperatur zu messen. Ziel dieser Technik ist es, den Anbau/Transfer von Kristallen in Glasspritzen zu ermöglichen, die direkt im Injektor zur seriellen Kristallographiedatenerfassung verwendet werden können. Zu den Vorteilen dieses Injektors gehört die Fähigkeit, schnell auf Veränderungen der Durchflussrate ohne Unterbrechung des Stroms zu reagieren. Für diesen Hochviskositätsinjektor (HVI) bestehen mehrere Einschränkungen, die eine Beschränkung der zulässigen Probenviskosität auf >10 Pa.s beinhalten. Die Streamstabilität kann je nach den spezifischen Eigenschaften der Stichprobe möglicherweise auch ein Problem darstellen. Ein detailliertes Protokoll zur Einrichtung von Proben und zum Betrieb des Injektors für serielle Kristallographiemessungen am australischen Synchrotron wird hier vorgestellt. Das Verfahren demonstriert die Vorbereitung der Probe, einschließlich der Übertragung von Lysozymkristallen in ein hochviskoses Medium (Silikonfett) und den Betrieb des Injektors zur Datenerfassung bei MX2.
Serielle Kristallographie (SX) ist eine Technik, die ursprünglich im Kontext von Röntgen-Freie-Elektronen-Laser (XFELs)1,2,3,4entwickelt wurde. Obwohl feste Zielansätze für SX5,6,7, in der Regel verwendet werden, um Kristalle in einem kontinuierlichen Strom an den Röntgenstrahl zu liefern. Da es Daten aus einer großen Anzahl von Kristallen kombiniert, vermeidet SX die Notwendigkeit einer Kristallausrichtung während des Experiments und ermöglicht die Erfassung von Daten bei Raumtemperatur8,9. Mit Hilfe eines geeigneten Injektors werden die Kristalle nacheinander in den Röntgen-Interaktionsbereich geströmt und die resultierenden Beugungsdaten auf einem Flächendetektor9,10gesammelt. Bis heute ist es SX gelungen, eine Reihe von Proteinstrukturen1,11,12,13 einschließlich Kristallen zu lösen, die zu klein sind, um sie mit konventioneller Kristallographie zu messen. Es hat auch neue Einblicke in die zeitaufgelöste molekulare Dynamik gegeben, indem es die Femtosekundenpulsdauer des XFEL ausnutzt. Durch die Initiierung von Pump-Sonden-Reaktionen mit optischen Laserquellen wurden eingehende Studien am Photosystem II14,15, photoaktivem gelben Protein16,17, Cytochrom C Oxidase18sowie Bakteriorhodopsin19,20,21durchgeführt. Diese Studien haben die Elektronentransferdynamik untersucht, die nach der Lichtaktivierung auftritt und das signifikante Potenzial der seriellen Kristallographie für das Verständnis zeitaufgelöster biologischer Prozesse demonstriert.
Die Entwicklung der seriellen Kristallographie wird auch an Synchrotronquellenimmerhäufiger 9,12,20,22,23,24. Synchrotron-basiertes SX ermöglicht es, eine große Anzahl einzelner Kristalle effizient bei Raumtemperatur mit einem geeigneten Injektorsystem zu messen. Dieser Ansatz eignet sich daher für kleinere Kristalle und erfordert nicht nur einen schnellen Framerate-Detektor, um die Daten zu erfassen, sondern auch einen mikrofokussierten Strahl. Im Vergleich zur konventionellen Kristallographie beinhaltet SX nicht die Montage und Ausrichtung einzelner Kristalle im Röntgenstrahl. Da Daten aus einer großen Anzahl einzelner Kristalle zusammengeführt werden, kann die von jedem Kristall empfangene Strahlendosis im Vergleich zur herkömmlichen Kristallographie erheblich reduziert werden. Synchrotron SX kann auch auf die Untersuchung von zeitaufgelösten Reaktionen angewendet werden, sogar bis zum Millisekundenregime, sofern ein Detektor mit einer ausreichend hohen Bildrate verfügbar ist (z. B. 100 Hz oder mehr). Mehrere serielle Kristallographie-Experimente wurden am Synchrotron mit Injektoren durchgeführt, die ursprünglich an XFEL-Quellen20,22,23entwickelt wurden. Die beiden häufigsten Arten von Injektoren sind die Gas Dynamic Virtual Nozzle (GDVN)25 und High Viscous Injector (HVI)9,24,26,27,28. Der GDVN ist ideal für die Injektion von Flüssigkeitsproben mit niedriger Viskosität, erfordert jedoch hohe Durchflussraten, um stabile Ströme zu erzielen, was wiederum zu hohen Abtastraten führt. Im Gegensatz dazu eignen sich DIE HVI für Proben mit hoher Viskosität, die die Erzeugung eines stabilen Stroms bei wesentlich niedrigeren Durchflussraten ermöglichen, was zu einem wesentlich geringeren Probenverbrauch führt. Der HVI-Injektor bevorzugt daher die Abgabe von Proben, bei denen ein viskoser Träger vorzuziehen ist (z. B. Lipidbasis für Membranproteine) und/oder große Probenmengen nicht verfügbar sind. SX-Injektoren sind in der Regel eine Herausforderung zu bedienen und erfordern umfangreiche Schulungen, um zu arbeiten. Sie beinhalten auch langwierige Probenübertragungsprotokolle, da die Probe in ein spezielles Reservoir geladen werden muss, was im Allgemeinen ein hohes Risiko mit sich bringt, dass probenentweder im “toten Volumen” oder durch Leckagen in den Anschlüssen verloren gehen. Daher ist es wünschenswert, das Injektor-Design zu optimieren, um Verluste zu verringern, bevor die Probe den Röntgenstrahl erreicht.
Kürzlich wurden die ersten SX-Ergebnisse mit Lipidico23 mit einem Lysozym-Ziel mit einem Eiger 16M-Detektor veröffentlicht. Dieses Injektordesign begrenzt die Probenverschwendung, indem die Anzahl der Schritte minimiert wird, die mit der ersten Kristallisation zum Transfer von Kristallen in den Injektor verbunden sind, gefolgt von der Abgabe der Probe an den Röntgenstrahl. Dieses Manuskript beschreibt und demonstriert das Probentransferverfahren, beginnend mit der Probenvorbereitung, dem Übergang zum Injektionsprozess und schließlich der Datenerfassung unter Verwendung desselben Kristallisationsgefäßes. Die Funktionsweise des Injektors wird ebenfalls beschrieben.
Es wurde eine alternative HVI entwickelt, ideal für die Durchführung von SX-Experimenten an Synchrotronquellen. Es hat zwei wesentliche Vorteile gegenüber bestehenden HVIs. Erstens ist es einfach, auf der Beamline zu installieren, so dass schnelles Umschalten zwischen konventioneller Kristallographie und SX ermöglicht wird, nur 30 Minuten sind für die Installation und Ausrichtung auf MX2 erforderlich. Zweitens können die Probenspritzen, die zum Anbau von Kristallen verwendet werden, direkt als Injektionsreservoirs …
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/) unterstützt. Diese Forschung wurde teilweise mit der MX2-Beamline am Australian Synchrotron, einem Teil von ANSTO, durchgeführt und verwendet den Detektor der Australian Cancer Research Foundation (ACRF).
Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |