Lipidico Injection Protocol för seriella kristallografimätningar vid den australiska synkrotronen
Summary
Målet med detta protokoll är att visa hur man förbereder seriella kristallografiprover för datainsamling på en hög viskös injektor, Lipidico, som nyligen beställdes på den australiska synkrotronen.
Abstract
En anläggning för att utföra seriella kristallografimätningar har utvecklats vid den australiska synkrotronen. Denna anläggning innehåller en specialbyggd hög viskös injektor, Lipidico, som en del av den makromolekylära kristallografin (MX2) beamline för att mäta ett stort antal små kristaller vid rumstemperatur. Målet med denna teknik är att göra det möjligt att odla/överföra kristaller till glassprutor direkt i injektorn för insamling av seriekristallografidata. Fördelarna med denna injektor inkluderar förmågan att reagera snabbt på förändringar i flödeshastigheten utan avbrott i strömmen. Det finns flera begränsningar för denna HVI-injektor (High Viscosity Injector) som inkluderar en begränsning av tillåtna provviskositeter till >10 Pa.s. Strömstabilitet kan också potentiellt vara ett problem beroende på exemplets specifika egenskaper. Ett detaljerat protokoll för hur man ställer in prover och använder injektorn för seriella kristallografimätningar vid den australiska synkrotronen presenteras här. Metoden visar beredning av provet, inklusive överföring av lysozymekristaller till ett högvisköst medium (silikonfett) och injektorns funktion för datainsamling vid MX2.
Introduction
Seriell kristallografi (SX) är en teknik som utvecklades ursprungligen i samband med röntgenfria elektronlasrar (XFELs)1,2,3,4. Även om fasta målinflygningar kan användas för SX5,6,7, vanligtvis används injektorsystem för att leverera kristaller i en kontinuerlig ström till röntgenstrålen. Eftersom det kombinerar data från ett stort antal kristaller undviker SX behovet av kristalljustering under experimentet och gör det möjligt att samla in data vid rumstemperatur8,9. Med hjälp av en lämplig injektor strömmas kristallerna en efter en till röntgeninteraktionsområdet och de resulterande diffraktionsdata samlas in på enområdesdetektor 9,10. Hittills har SX lyckats lösa ett antal proteinstrukturer1, 11,12,13inklusive kristaller för små för att mäta med konventionell kristallografi. Det har också gett nya insikter om tidsupp lös molekylär dynamik genom att utnyttja XFEL: s femtosekerade pulsvaraktighet. Genom att initiera pumpsondreaktioner med optiska laserkällor har djupgående studier utförts på fotosystem II14,15, fotoaktivt gult protein16,17, cytokrom C oxidas18, liksom bakteriorhodopsin19,20,21. Dessa studier har undersökt elektronöverföringsdynamiken som uppstår efter ljusaktivering som visar den betydande potentialen hos seriell kristallografi för att förstå tids lösta biologiska processer.
Utveckling av seriell kristallografi blir också allt vanligare vid synkrotronkällor9,12,20,22,23,24. Synkrotronbaserade SX gör det möjligt att mäta ett stort antal enskilda kristaller effektivt vid rumstemperatur med hjälp av ett lämpligt injektorsystem. Detta tillvägagångssätt är lämpligt för mindre kristaller, förutom att kräva en snabb bildhastighetsdetektor för att samla in data, krävs också en mikrofokuserad stråle. Jämfört med konventionell kristallografi innebär SX inte montering och justering av enskilda kristaller i röntgenstrålen. Eftersom data från ett stort antal enskilda kristaller slås samman kan stråldosen som tas emot av varje kristall minskas avsevärt jämfört med konventionell kristallografi. Synkrotron SX kan också tillämpas på studier av tidsuppfriade reaktioner, även ner till millisekekondriska systemet, förutsatt att en detektor med en tillräckligt hög bildhastighet finns tillgänglig (t.ex. 100 Hz eller mer). Flera seriella kristallografi experiment har utförts vid synkrotronen med hjälp av injektorer som ursprungligen utvecklades vid XFEL källor20,22,23. De två vanligaste typerna av injektor är Gas Dynamic Virtual Nozzle (GDVN)25 och High Viscous Injector (HVI)9,24,26,27,28. GDVN är idealisk för att injicera låg viskositet, flytande prover, men kräver höga flödeshastigheter för att uppnå stabila strömmar, vilket i sin tur leder till höga provförbrukningshastigheter. Däremot är HVI: s lämpliga för prover med hög viskositet som möjliggör generering av en stabil ström vid mycket lägre flödeshastigheter, vilket leder till mycket lägre provförbrukning. HVI-injektorn föredrar därför leverans av prover där en trögflytande bärare är att föredra (t.ex. lipidbaserad för membranproteiner) och/eller stora mängder prov inte finns tillgängliga. SX-injektorer är i allmänhet utmanande att använda och kräver omfattande utbildning för att fungera. De omfattar också långa protokoll för överföring av prover, eftersom provet måste laddas i en specialiserad reservoar, vilket i allmänhet har en hög risk i samband med att provet går förlorat antingen i “död volym” eller via läckage i anslutningarna. Därför är det önskvärt att optimera injektordesignen för att mildra eventuella förluster innan provet når röntgenstrålen.
Nyligen publicerades de första SX-resultaten med Lipidico23 med ett lysozyme-mål, med hjälp av en Eiger 16M-detektor. Denna injektordesign begränsar provslöseriet genom att minimera antalet steg som är involverade i att gå från inledande kristallisering till överföring av kristaller till injektorn följt av provleverans till röntgenstrålen. Detta manuskript beskriver och demonstrerar provöverföringsproceduren från provberedning, går vidare till injektionsprocessen och slutligen datainsamling med samma kristalliseringskärl. Injektorns funktion beskrivs också.
Protocol
Representative Results
Discussion
En alternativ HVI har utvecklats, perfekt för att utföra SX-experiment på synkrotronkällor. Det har två viktiga fördelar jämfört med befintliga HVIs. För det första är det enkelt att installera på strållinjen vilket möjliggör snabb växling mellan konventionell kristallografi och SX, bara ~ 30 minuter krävs för installation och justering på MX2. För det andra kan provsprutorna som används för att odla kristaller användas direkt som reservoarer för injektion, vilket begränsar slöseriet under prov?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Denna forskning utfördes delvis med hjälp av MX2-strållinjen vid Australian Synchrotron, en del av ANSTO, och använde sig av Australian Cancer Research Foundation (ACRF) detektor.
Materials
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
References
- Boutet, S., et al. High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography. Science. 337 (6092), 362-364 (2012).
- Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. X-ray lasers for structural and dynamic biology. Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601 (2012).
- Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).
- Lee, D., et al. Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 9, 6971 (2019).
- Martin, A. V., et al. Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases. Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).
- Roedig, P., et al. High-speed fixed-target serial virus crystallography. Nature Methods. 14 (8), 805 (2017).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-81 (2011).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5, 3309 (2014).
- Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
- Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
- Nam, K. H. Sample delivery media for serial crystallography. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094 (2019).
- Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), 1600292 (2016).
- Kern, J., et al. Structures of the intermediates of Kok’s photosynthetic water oxidation clock. Nature. 563 (7731), 421 (2018).
- Suga, M., et al. An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser. Science. 366 (6463), 334-338 (2019).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
- Ishigami, I., et al. Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).
- Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).
- Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 361 (6398), (2018).
- Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).
- Berntsen, P., et al. The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the “Lipidico” injector. Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110 (2019).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).
- DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N., Tschentscher, T., Cocco, D. Sample injection for pulsed X-ray sources. Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. , 8078 (2011).
- Park, S. Y., Nam, K. H. Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).
- Shimazu, Y., et al. High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure. Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).
- Kovacsova, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).
- Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345 (2016).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).
- Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6, 24484 (2016).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Hadian-Jazi, M., et al. A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography. Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).
- Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art. Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).
