Succesvolle In vivo Calcium Imaging met een Head-Mount Miniaturized Microscope in de Amygdala van Freely Behaving Mouse
Summary
In vivo micro-endoscopische calciumbeeldvorming is een onschatbaar hulpmiddel dat real-time monitoring van neuronale activiteiten bij vrijdragende dieren mogelijk maakt. Het toepassen van deze techniek op de amygdala was echter moeilijk. Dit protocol is bedoeld om een nuttige richtlijn te bieden voor het succesvol richten op amygdalacellen met een geminiaturiseerde microscoop bij muizen.
Abstract
In vivo real-time monitoring van neuronale activiteiten bij vrij bewegende dieren is een van de belangrijkste benaderingen om neuronale activiteit te koppelen aan gedrag. Voor dit doel is een in vivo beeldvormingstechniek ontwikkeld die calciumtransiënten in neuronen detecteert met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI’s), een geminiaturiseerde fluorescentiemicroscoop en een gradiënt brekingsindex (GRIN) lens is ontwikkeld en met succes toegepast op veel hersenstructuren1,2,3,4,5,6. Deze beeldvormingstechniek is bijzonder krachtig omdat het chronische gelijktijdige beeldvorming van genetisch gedefinieerde celpopulaties mogelijk maakt voor een langdurige periode tot enkele weken. Hoewel nuttig, is deze beeldvormingstechniek niet gemakkelijk toegepast op hersenstructuren die zich diep in de hersenen bevinden, zoals amygdala, een essentiële hersenstructuur voor emotionele verwerking en associatief angstgeheugen7. Er zijn verschillende factoren die het moeilijk maken om de beeldvormingstechniek toe te passen op de amygdala. Bewegingsartefacten komen bijvoorbeeld meestal vaker voor tijdens de beeldvorming in de diepere hersengebieden, omdat een hoofdsteunmicroscoop die diep in de hersenen is geïmplanteerd relatief onstabiel is. Een ander probleem is dat de laterale ventrikel dicht bij de geïmplanteerde GRIN-lens is geplaatst en dat de beweging tijdens de ademhaling zeer onregelmatige bewegingsartefacten kan veroorzaken die niet gemakkelijk kunnen worden gecorrigeerd, waardoor het moeilijk is om een stabiel beeldbeeld te vormen. Bovendien, omdat cellen in de amygdala meestal stil zijn in een rustende of verdoofde toestand, is het moeilijk om de doelcellen te vinden en te concentreren die GECI uitdrukken in de amygdala tijdens de bodemplaatprocedure voor latere beeldvorming. Dit protocol biedt een nuttige richtlijn voor het efficiënt targeten van cellen die GECI uitdrukken in de amygdala met head-mount geminiaturiseerde microscoop voor succesvolle in vivo calcium beeldvorming in zo’n dieper hersengebied. Opgemerkt wordt dat dit protocol is gebaseerd op een bepaald systeem (bijv. Inscopix) maar niet beperkt tot het.
Introduction
Calcium is een alomtegenwoordige tweede boodschapper en speelt een cruciale rol in bijna elke cellulaire functie8. Bij neuronen veroorzaken actiepotentieel afvuren en synaptische input een snelle verandering van intracellulaire vrije [Ca2+]9,10. Daarom biedt het volgen van calciumtransiënten de mogelijkheid om neuronale activiteit te volgen. GECI ‘s zijn krachtige hulpmiddelen die het mogelijk maken [Ca2+] te monitoren in gedefinieerde celpopulaties en intracellulairecompartimenten 11,12. Onder veel verschillende soorten op eiwitten gebaseerde calciumindicator is GCaMP, een Ca2+ sonde op basis van een enkel GFP-molecuul13,de meest geoptimaliseerde en dus veel gebruikte GECI. Door middel van meerdere engineeringrondes is een aantal varianten van GCaMP ontwikkeld12,14,15,16. We gebruiken een van de recent ontwikkelde HUISARTSEN, GCaMP7b, in dit protocol16. GCaMP-sensoren hebben sterk bijgedragen aan de studie van neurale circuitfuncties in een aantal modelorganismen zoals beeldvorming van Ca2+ transiënten tijdens ontwikkeling17, in vivo beeldvorming in een specifieke corticale laag18, meting van circuitdynamiek in motorisch taakleren19 en beeldvorming van celensembleactiviteit gerelateerd aan associatief angstgeheugen in de hippocampus en amygdala20,21.
Optische beeldvorming van GECI’s heeft verschillende voordelen22. Genetische codering maakt het mogelijk om GECI’s gedurende een lange periode stabiel uit te drukken in een specifieke subset van cellen die worden gedefinieerd door genetisch profiel of specifieke patronen van anatomische connectiviteit. Optische beeldvorming maakt in vivo chronische gelijktijdige monitoring van honderden tot duizenden neuronen bij levende dieren mogelijk. Er zijn enkele optische beeldvormingssystemen ontwikkeld voor in vivo beeldvorming en analyse van GECI ‘s in de hersenen van vrijdragende muizen met head-mount geminiaturiseerde fluorescentiemicroscopen21,23,24,25. Ondanks dat de in vivo optische beeldvormingstechniek op basis van GECI’s, GRIN-lens en een miniatuurmicroscoop met kopsteun een krachtig hulpmiddel is om het verband tussen neurale circuitactiviteit en gedrag te bestuderen, is het toepassen van deze technologie op de amygdala moeilijk geweest vanwege verschillende technische problemen met het richten van de GRIN-lens op cellen die GECI’s in de amygdala uitdrukken zonder bewegingsartefacten te veroorzaken die de kwaliteit van beeldverwerving ernstig verminderen en cellen vinden die GECI’s uitdrukken. Dit protocol is bedoeld om een nuttige richtlijn te bieden voor chirurgische procedures van baseplate attachment en GRIN lensimplantatie die kritieke stappen zijn voor succesvolle in vivo optische calciumbeeldvorming in de amygdala. Hoewel dit protocol zich richt op de amygdala, zijn de meeste hier beschreven procedures algemeen toepasbaar op andere diepere hersengebieden. Hoewel dit protocol is gebaseerd op een bepaald systeem (bijv. Inscopix), kan hetzelfde doel gemakkelijk worden bereikt met andere alternatieve systemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bekwame operatietechnieken zijn essentieel voor het bereiken van succesvolle in vivo optische calciumbeeldvorming met head-mount miniatuurmicroscopie in diepere hersengebieden zoals de amygdala zoals we hier beschreven. Daarom, hoewel dit protocol een richtlijn biedt voor geoptimaliseerde chirurgische processen van basisplaatbevestiging en GRIN-lensimplantatie, kunnen aanvullende optimalisatieprocessen nodig zijn voor kritieke stappen. Zoals vermeld in de protocolsectie, moeten amygdala-coördinaten in chirurgie, luchtst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van De Stichting van de Wetenschap en van de Technologie van Samsung (Projectnummer SSTF-BA1801-10).
Materials
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
References
- Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
- Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram. Nature Communications. 10 (1), 2637 (2019).
- Grundemann, J., et al. Amygdala ensembles encode behavioral states. Science. 364 (6437), (2019).
- Krabbe, S., et al. Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning. Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Burgoyne, R. D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).
- Miyakawa, H., et al. Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels. Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).
- Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. Imaging calcium dynamics in dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Huber, D., et al. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Grewe, B. F., et al. Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Jacob, A. D., et al. A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128 (2017).
- Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Millhouse, O. E., DeOlmos, J. Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala. Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).
- McDonald, A. J. Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).
- McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).
