سلالة تسيطر عليها من هيدروجيلس 3D تحت التصوير المجهري لايف
Summary
تتضمن الطريقة المقدمة التمدد الأحادي من الهيدروجيلات الناعمة ثلاثية الأبعاد المضمنة في مطاط السيليكون مع السماح بالفحص المجهري البؤري الحي. يتم توضيح توصيف سلالات الهيدروجيل الخارجية والداخلية وكذلك محاذاة الألياف. الجهاز والبروتوكول وضعت يمكن تقييم استجابة الخلايا لمختلف أنظمة سلالة.
Abstract
القوى الخارجية هي عامل مهم في تكوين الأنسجة، والتنمية، والصيانة. وغالبا ما تدرس آثار هذه القوى باستخدام أساليب متخصصة في تمديد المختبر. تستخدم مختلف الأنظمة المتاحة نقالات تعتمد على الركيزة ثلاثية الأبعاد ، في حين أن إمكانية الوصول إلى التقنيات ثلاثية الأبعاد لإجهاد الهيدروجيلات الناعمة ، أكثر تقييدا. هنا، ونحن نصف الطريقة التي تسمح تمتد الخارجية من الهيدروجيل لينة من محيطها، وذلك باستخدام شريط سيليكون مرنة كما الناقل عينة. تم بناء نظام التمدد المستخدمة في هذا البروتوكول من أجزاء مطبوعة ثلاثية الأبعاد وإلكترونيات منخفضة التكلفة ، مما يجعل من السهل والسهل تكرارها في مختبرات أخرى. تبدأ العملية التجريبية مع البلمرة سميكة (>100 ميكرومتر) هيدروجيلس الفيبرين لينة (معامل مرن من ~ 100 السلطة الفلسطينية) في قطع التدريجي في وسط قطاع السيليكون. ثم يتم إرفاق بنى السيليكون هلام إلى الجهاز المطبوع تمتد ووضعها على مرحلة المجهر confocal. تحت المجهر الحي يتم تنشيط جهاز التمدد ، ويتم تصوير المواد الهلامية ب مقادير مختلفة للتمدد. ثم يتم استخدام معالجة الصور لتحديد تشوهات الجل الناتجة ، مما يدل على سلالات متجانسة نسبيا ومحاذاة الألياف في جميع أنحاء سمك الجل ثلاثي الأبعاد(Z-axis). وتشمل مزايا هذه الطريقة القدرة على إجهاد الهيدروجيلات الناعمة للغاية في 3D أثناء تنفيذ المجهر في الموقع ، وحرية التلاعب في هندسة وحجم العينة وفقا لاحتياجات المستخدم. بالإضافة إلى ذلك ، مع التكيف السليم ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتمديد أنواع أخرى من الهيدروجيل (على سبيل المثال ، الكولاجين أو البولي أكريلاميد أو البولي إيثيلين غليكول) ويمكن أن تسمح بتحليل استجابة الخلايا والأنسجة للقوى الخارجية في ظل ظروف ثلاثية الأبعاد أكثر محاكاة بيولوجيا.
Introduction
استجابة الأنسجة للقوى الميكانيكية هي جزء لا يتجزأ من مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية، بما في ذلك التعبير الجيني1،تمايز الخلايا2،وإعادة عرض الأنسجة3. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تؤثر التغيرات الناجمة عن القوة في المصفوفة خارج الخلية (ECM) مثل محاذاة الألياف والتكثيف على سلوك الخلية وتكوين الأنسجة4و5و6. هيكل شبكة ليفية في ECM له خصائص ميكانيكية مثيرة للاهتمام، مثل مرونة غير خطية، تشوه غير affine والتشوهات البلاستيكية7،8،9،10،11،12. تؤثر هذه الخصائص على كيفية استجابة الخلايا والبيئة الدقيقة المحيطة بها للقوى الميكانيكية الخارجية13و14. إن فهم كيفية استجابة ECM والأنسجة للقوى الميكانيكية سيمكن من التقدم في مجال هندسة الأنسجة وفي تطوير نماذج حسابية ونظرية أكثر دقة.
وقد ركزت الطرق الأكثر شيوعا لتمديد العينات ميكانيكيا على الركائز 2D محملة بالخلايا لاستكشاف الآثار على سلوك الخلية. وتشمل هذه، على سبيل المثال، تطبيق سلالة على ركائز البوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS) وتحليل زوايا إعادة توجيه الخلية فيما يتعلق اتجاه التمدد15،16،17،18،19. ومع ذلك ، فإن الأساليب التي تحقق في استجابة الهيدروجيلات المدمجة في الخلايا ثلاثية الأبعاد للتمدد الخارجي ، وهي حالة تحاكي بشكل وثيق البيئة الدقيقة للأنسجة ، هي أكثر محدودية. التقدم نحو طرق التمدد ثلاثي الأبعاد ذات أهمية خاصة لأن الخلايا تتصرف بشكل مختلف على الركائز 2D بالمقارنة مع المصفوفات ثلاثية الأبعاد20. وتشمل هذه السلوكيات إعادة تنظيم الخلوية, مستويات التعبير البروتين, وأنماط الهجرة21,22,23.
وتشمل الأساليب والأجهزة التي تسمح لتمتد عينة 3D على حد سواء المتاحة تجاريا24،25،26،27،28 وتلك التي وضعت للبحوث المختبرية29. هذه الأساليب استخدام أنابيب السيليكون distensible30، غرف متعددةالآبار 31، المشابك26،32، المفاعلات الحيوية11،33، cantilevers34،35،36، والمغناطيس37،38. بعض التقنيات تولد تمتد أن تشوه محليا هيدروجيلس 3D، على سبيل المثال عن طريق سحب الإبر من نقطتين واحدة في هلام5،في حين أن البعض الآخر يسمح لتشوه الجزء الأكبر بأكمله من هلام16. وعلاوة على ذلك، تركز معظم هذه النظم على تحليل حقل السلالة في الطائرة X-Y، مع معلومات محدودة عن حقل السلالة في الاتجاه Z. بالإضافة إلى ذلك ، فقط عدد قليل من هذه الأجهزة قادرة على التصوير المجهري في الموقع. التحدي الرئيسي مع التصوير عالي التكبير في الموقع (على سبيل المثال ، المجهر confocal) هو مسافة عمل محدودة من بضع مئات من الميكرونات من العدسة الموضوعية إلى العينة. الأجهزة التي تسمح بالتصوير الحي أثناء التمدد تضحي بتوحيد السلالة في المحور Zأو معقدة نسبيا ويصعب تكاثرها في مختبرات أخرى39،40.
هذا النهج لتمتد هيدروجيلس 3D يسمح لسلالة أحادية ساكسية ثابتة أو دورية خلال المجهر الكونف البؤري الحية. تم إنشاء جهاز التمدد (المشار إليه باسم “نقالة أحادية ساكسال ذكية – SCyUS”) باستخدام أجزاء مطبوعة ثلاثية الأبعاد وأجهزة منخفضة التكلفة ، مما يسمح بالاستنساخ السهل في مختبرات أخرى. تعلق على الجهاز هو المطاط السيليكون المتاحة تجاريا مع قطع هندسية التدريجي في وسطها. يتم بلمرة مكونات هيدروجيل لملء قطع التدريجي. أثناء البلمرة ، تلتزم الهيدروجيلات البيولوجية ، مثل الفيبرين أو الكولاجين ، بشكل طبيعي بالجدران الداخلية للقطع. باستخدام SCyUS ، يتم تمديد قطاع السيليكون بشكل غير ضروري ، ونقل السلالات الخاضعة للرقابة إلى هيدروجيل 3Dالمضمنة 41.
هذا النظام يسمح لمزيج فريد من الميزات والمزايا مقارنة مع غيرها من الأساليب القائمة. أولا، يسمح النظام بتمديد أحادي ساكسال الهيدروجيلات الناعمة ثلاثية الأبعاد السميكة (سمك >100 ميكرومتر، <1 كيلو باسكال صلابة) من أطرافها، مع تشوه Z-متجانسفي جميع أنحاء الهيدروجيل. هذه الهيدروجيلات لينة جدا لتكون مسيطرة وامتدت من قبل تقنيات الشد التقليدية. ثانيا، يمكن تكرار جهاز التمدد بسهولة في مختبرات أخرى لأن الطباعة ثلاثية الأبعاد متاحة بسهولة للباحثين والإلكترونيات المستخدمة في التصميم منخفضة التكلفة. ثالثا، وربما الميزة الأكثر جاذبية، يمكن التلاعب بسهولة الهندسة وحجم القطع في قطاع السيليكون، مما يسمح لتدرجات سلالة غير قادر وظروف الحدود، فضلا عن استخدام مجموعة متنوعة من أحجام العينة، وصولا الى عدد قليل من microliters.
البروتوكول المقدم يتكون من صب هلام الفيبرين إلى أقراص قطرها ~ 2 ملم في شرائط مطاطية سميكة سيليكون 0.5 ملم التي شرع فيها تمتد أحادية الجنس تحت المجهر الكونفوكوكال الحية. فيما يلي يناقش بالتفصيل الإجراءات التجريبية لقياس وتحليل السلالات التي تعمل على قطع هندسية التدريجي، وسلالات الداخلية وضعت في هيدروجيل، فضلا عن محاذاة الألياف الناتجة بعد التلاعب تمتد مختلفة. وأخيرا، تتم مناقشة إمكانية تضمين الخلايا في الهيدروجيل وتعريضها للتمدد الخارجي الخاضع للرقابة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تستند الطريقة والبروتوكول المعروضين هنا إلى حد كبير على دراستنا السابقة من قبل Roitblat Riba وآخرون.
وتشمل المزايا الرئيسية للطريقة المعروضة على النهج القائمة إمكانية إجهاد الهيدروجيلات ثلاثية الأبعاد الناعمة جدا (معامل مرن من ~ 100 باسكال) من محيطها ، وتحت التص…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تكييف بعض الأرقام المدرجة هنا بإذن من مركز إزالة حقوق الطبع والنشر: سبرينغر الطبيعة، حوليات الهندسة الطبية الحيوية. إجهاد الهيدروجيلات ثلاثية الأبعاد بسلالات موحدة من محور z مع تمكين التصوير المجهري الحي ، A. Roitblat Riba ، S. Natan ، A. Kolel ، H. Rushkin ، O. Tchaicheeyan ، A. Lesman ، حقوق الطبع والنشر © (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
Materials
| Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20002 | |
| Cell Medium (DMEM High Glucose) | Biological Industries | 01-052-1A | Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate |
| Cover Slip #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22×40 mm |
| DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO | Sigma-Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-1A | |
| EVICEL Fibrin Sealant (Human) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL |
| Fibrinogen Buffer | N/A | Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2) | |
| Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) | Invitrogen | F8820 | Orange (540/560) Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide |
| High-Temperature Silicone Rubber | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µm-thick E = 1.5 Mpa Poisson Ratio = 0.48 Tensile Strength = 4.8 MPa Upper limit of stretch = +300% engineering strain |
| HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
| HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | HIVAC-G 100 | |
| ImageJ FIJI software39 | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
| Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) | Arduino/Adafruit | Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
| MicroVL 21R Centrifuge | Thermo Scientific | 75002470 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Primovert Light Microscope | Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
| SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systèmes | N/A | |
| SCyUS Code37 | N/A | N/A | |
| Servomotor – TowerPro SG-5010 | Adafruit | 155 | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | For 50 mL tubes |
| Sterile 10 cm non-culture plates | Corning | 430167 | |
| Thrombin buffer | N/A | Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0) | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1B | |
| USB Cable (Type B Male to Type A Male) | N/A | N/A | |
| Zeiss LSM 880 Confocal Microscope | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
| ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) | Carl Zeiss AG | Release Version 14.0.0.0 |
References
- Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816 (2015).
- Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cyclic strain drives assembly and differentiation of skeletal myocytes. Tissue Engineering Part A. 17, 2543-2550 (2011).
- Grodzinsky, A. J., Levenston, M. E., Jin, M., Frank, E. H. Cartilage Tissue Remodeling in Response to Mechanical Forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2 (1), 691-713 (2000).
- Munster, S., et al. Strain history dependence of the nonlinear stress response of fibrin and collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, 12197-12202 (2013).
- Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS ONE. 4, 5902 (2009).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 377-383 (2002).
- Natan, S., Koren, Y., Shelah, O., Goren, S., Lesman, A. . Molecular Biology of the Cell. 31 (14), 1474-1485 (2020).
- Ban, E., et al. Mechanisms of Plastic Deformation in Collagen Networks Induced by Cellular Forces. Biophysical Journal. 114 (2), 450-461 (2018).
- Kim, J., et al. Stress-induced plasticity of dynamic collagen networks. Nature Communications. 8, 842 (2017).
- Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
- Wen, Q., Basu, A., Janmey, P. A., Yodh, A. G. Non-affine deformations in polymer hydrogels. Soft Matter. 8, 8039-8049 (2012).
- Muiznieks, L. D., Keeley, F. W. Molecular assembly and mechanical properties of the extracellular matrix: A fibrous protein perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1832, 866-875 (2012).
- Brown, A. E. X., Litvinov, R. I., Discher, D. E., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Multiscale mechanics of fibrin polymer: gel stretching with protein unfolding and loss of water. Science. 325, 741-744 (2009).
- Carroll, S. F., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Cyclic tensile strain can play a role in directing both intramembranous and endochondral ossification of mesenchymal stem cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 73 (2017).
- Livne, A., Bouchbinder, E., Geiger, B. Cell reorientation under cyclic stretching. Nature Communications. 5, 3938 (2014).
- Wang, L., et al. Patterning cellular alignment through stretching hydrogels with programmable strain gradients. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 15088-15097 (2015).
- Xu, G. K., Feng, X. Q., Gao, H. Orientations of Cells on Compliant Substrates under Biaxial Stretches: A Theoretical Study. Biophysical Journal. 114 (3), 701-710 (2017).
- Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2013).
- Lu, J., et al. Cell orientation gradients on an inverse opal substrate. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (19), 10091-10095 (2015).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
- Bono, N., et al. Unraveling the role of mechanical stimulation on smooth muscle cells: a comparative study between 2D and 3D models. Biotechnology and Bioengineering. 113, 2254-2263 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Riehl, B. D., Park, J. H., Kwon, I. K., Lim, J. Y. Mechanical stretching for tissue engineering: two-dimensional and three-dimensional constructs. Tissue Engineering Part B: Reviews. 18, 288-300 (2012).
- Flexcell. Linear Tissue Train Culture Plate. Flexcell. , (2019).
- Flexcell. Tissue Train. Flexcell. , (2019).
- CellScale. MCT6 Stretcher. CellScale. , (2019).
- STREX. STB-150. STREX. , (2019).
- STREX. Stretch Chambers. STREX. , (2019).
- Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab on a Chip. 16, 3193-3203 (2016).
- Weidenhamer, N. K., Tranquillo, R. T. Influence of cyclic mechanical stretch and tissue constraints on cellular and collagen alignment in fibroblast-derived cell sheets. Tissue Engineering Part C: Methods. 19, 386-395 (2013).
- Yung, Y. C., Vandenburgh, H., Mooney, D. J. Cellular strain assessment tool (CSAT): precision-controlled cyclic uniaxial tensile loading. Journal of Biomechanics. 42, 178-182 (2009).
- Chen, K., et al. Role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 115, 986-991 (2018).
- Heher, P., et al. A novel bioreactor for the generation of highly aligned 3D skeletal muscle-like constructs through orientation of fibrin via application of static strain. Acta Biomaterialia. 24, 251-265 (2015).
- Foolen, J., Deshpande, V. S., Kanters, F. M. W., Baaijens, F. P. T. The influence of matrix integrity on stress-fiber remodeling in 3D. Biomaterials. 33, 7508-7518 (2012).
- Walker, M., Godin, M., Pelling, A. E. A vacuum-actuated microtissue stretcher for long-term exposure to oscillatory strain within a 3D matrix. Biomedical Microdevices. 20, 43 (2018).
- Zhao, R. G., Boudou, T., Wang, W. G., Chen, C. S., Reich, D. H. Decoupling cell and matrix mechanics in engineered microtissues using magnetically actuated microcantilevers. Advanced Materials. 25, 1699-1705 (2013).
- Li, Y. H., et al. Magnetically actuated cell-laden micro-scale hydrogels for probing strain-induced cell responses in three dimensions. NPG Asia Materials. 8, 238 (2016).
- Li, Y. H., et al. An approach to quantifying 3D responses of cells to extreme strain. Scientific Reports. 6, 19550 (2016).
- Humphrey, J. D., et al. A theoretically-motivated biaxial tissue culture system with intravital microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 7, 323-334 (2008).
- Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 107, 3335-3339 (2010).
- Roitblat Riba, A., et al. Straining 3D hydrogels with uniform z-axis strains while enabling live microscopy imaging. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
- Gomez, D., Natan, S., Shokef, Y., Lesman, A. Mechanical interaction between cells facilitates molecular transport. Advanced Biosystems. 3 (12), 1900192 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open- source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- EPFL Switzerland. OrientationJ plug in. EPFL Switzerland. , (2019).
- Goren, S., Koren, Y., Xu, X., Lesman, A. Elastic anisotropy governs the decay of cell-induced displacements. Biophysical Journal. 118 (5), 1152-1164 (2019).
- Notbohm, J., Lesman, A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Quantifying cell-induced matrix deformation in three dimensions based on imaging matrix fibers. Integrative Biology. 7 (10), 1186-1195 (2015).
- Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. Journal of Cell Biology. 205 (2), 155-162 (2014).
- Cha, C. Y., et al. Tailoring Hydrogel Adhesion to Polydimethylsiloxane Substrates Using Polysaccharide Glue. Angewandte Chemie International Edition. 52, 6949-6952 (2019).
- Wirthl, D., et al. Instant tough bonding of hydrogels for soft machines and electronics. Science Advances. 3, (2017).
- Juarez-Moreno, J. A., Avila-Ortega, A., Oliva, A. I., Aviles, F., Cauich-Rodriguez, J. V. Effect of wettability and surface roughness on the adhesion properties of collagen on PDMS films treated by capacitively coupled oxygen plasma. Applied Surface Science. 349, 763-773 (2015).
- Kim, H. T., Jeong, O. C. PDMS surface modification using atmospheric pressure plasma. Microelectronic Engineering. 88, 2281-2285 (2011).
- Prasad, B. R., et al. Controlling cellular activity by manipulating silicone surface roughness. Colloids and Surfaces. 78, 237-242 (2010).
