השיטה המוצגת כוללת מתיחה חד-אקסיאלית של הידרוג’לים רכים תלת-ממדיים המוטמעים בגומי סיליקון תוך מתן אפשרות למיקרוסקופיה קונפוקלית חיה. אפיון של זני הידרוג’ל חיצוניים ופנימיים, כמו גם יישור סיבים מודגמים. המכשיר והפרוטוקול שפותחו יכולים להעריך את התגובה של תאים למשטרי זנים שונים.
כוחות חיצוניים הם גורם חשוב בהיווצרות רקמות, פיתוח ותחזוקה. ההשפעות של כוחות אלה נחקרים לעתים קרובות באמצעות שיטות מתיחות במבחנה מיוחדות. מערכות זמינות שונות משתמשות באלונקות דו-ממדיות מבוססות מצע, בעוד שהנגישות של טכניקות תלת-ממד למאמץ הידרוג’לים רכים מוגבלת יותר. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת מתיחה חיצונית של הידרוג’לים רכים מהיקפם, תוך שימוש ברצועת סיליקון אלסטית כנשא המדגם. מערכת המתיחה המנוצלת בפרוטוקול זה בנויה מחלקים המודפסים בתלת-ממד ומאלקטרוניקה בעלות נמוכה, מה שהופך אותה לפשוטה וקלה לשכפול במעבדות אחרות. התהליך הניסיוני מתחיל עם polymerizing עבה (>100 מיקרומטר) הידרוג’לים פיברין רך (מודולוס אלסטי של ~ 100 Pa) בחיתוך במרכז רצועת סיליקון. לאחר מכן, מבני ג’ל סיליקון מחוברים למכשיר המתיחה המודפס ומונחים על שלב המיקרוסקופ הקונפוקל. תחת מיקרוסקופיה חיה מופעל מכשיר המתיחה, והג’לים מצולמים בסדרי גודל שונים של מתיחות. לאחר מכן נעשה שימוש בעיבוד תמונה לכימות עיוותי הג’ל הנובעים מכך, תוך הפגנת זנים הומוגניים יחסית ויישור סיבים בעובי התלת-ממדי של הג’ל (ציר Z). היתרונות של שיטה זו כוללים את היכולת להתאמץ הידרוג’לים רכים מאוד בתלת מימד תוך ביצוע במיקרוסקופיה situ, ואת החופש לתפעל את הגיאומטריה ואת גודל המדגם על פי צרכי המשתמש. בנוסף, עם הסתגלות נכונה, שיטה זו יכולה לשמש כדי למתוח סוגים אחרים של הידרוג’לים (למשל, קולגן, פוליאקרילאמיד או פוליאתילן גליקול) והוא יכול לאפשר ניתוח של תאים ותגובת רקמות לכוחות חיצוניים בתנאים ביומטיים יותר 3D.
תגובת רקמות לכוחות מכניים היא חלק בלתי נפרד ממגוון רחב של פונקציות ביולוגיות, כולל ביטויגנים 1, התמיינות תאים2, ושיפוץרקמות 3. יתר על כן, שינויים הנגרמים על ידי כוח במטריצה חוץ תאית (ECM) כגון יישור סיבים ו densification יכול להשפיע על התנהגות התא היווצרותרקמות 4,5,6. מבנה הרשת הסיבית של ECM יש תכונות מכניות מסקרנות, כגון גמישות לא ליניארית, עיוות שאינו affine ועיוותים פלסטיק7,8,9,10,11,12. מאפיינים אלה משפיעים על האופן שבו תאים ומיקרו-וירוסים הסובבים אותם מגיבים לכוחות מכניים חיצוניים13,14. הבנת האופן שבו ה-ECM והרקמות מגיבים לכוחות מכניים תאפשר התקדמות בתחום הנדסת הרקמות ובפיתוח מודלים חישוביים ותיאורטיים מדויקים יותר.
השיטות הנפוצות ביותר למתוח דגימות מכני התמקדו מצעים דו-מימדיים עמוסי תאים כדי לחקור את ההשפעות על התנהגות התא. אלה כוללים, למשל, החלת זן על מצעים polydimethylsiloxane (PDMS) וניתוח זוויות כיוונון מחדש של התא ביחס לכיוון המתיחה15,16,17,18,19. עם זאת, שיטות החוקרות את התגובה של הידרוג’לים משובצים בתאים תלת-ממדיים למתיחה חיצונית, מצב המחקה באופן הדוק יותר מיקרו-וירוס רקמות, מוגבלות יותר. ההתקדמות לקראת שיטות מתיחה תלת-ממדיות היא בעלת חשיבות מיוחדת מכיוון שהתאים מתנהגים באופן שונה במצעים דו-ממדיים בהשוואה למטריצות תלת-ממדיות20. התנהגויות אלה כוללות יישור מחדש של התאים, רמות ביטוי חלבון ודפוסיהגירה 21,22,23.
שיטות והתקנים המאפשרים מתיחה מדגם 3D כוללים הן מסחרי זמין24,25,26,27,28 ואלה שפותחו למחקר מעבדה29. שיטות אלה משתמשות בצינורות סיליקון נפוחים30, תאים מרובי בארות31, מלחציים26,32, bioreactors11,33, cantilevers34,35,36, ומגנטים37,38. טכניקות מסוימות יוצרות מתיחה המעוותת באופן מקומי הידרוג’לים תלת-ממדיים, למשל על ידי משיכת מחטים משתי נקודות בודדות בג’ל5, בעוד שאחרות מאפשרות עיוות של כל החלק הארי של הג’ל16. יתר על כן, רוב המערכות הללו מתמקדות בניתוח שדה המתח במישור X-Y, עם מידע מוגבל על שדה המתח בכיוון Z. בנוסף, רק קומץ של התקנים אלה מסוגלים מיקרוסקופי בהדמיה situ. האתגר העיקרי בהדמיית הגדלה גבוהה (למשל, מיקרוסקופ קונפוקל) הוא מרחק העבודה המוגבל של כמה מאות מיקרון מהעדשה האובייקטיבית למדגם. מכשירים המאפשרים הדמיה חיה במהלך מתיחה מקריבים את אחידות המתח בציר Zאו מורכבים יחסית וקשים להתרבות במעבדות אחרות39,40.
גישה זו למתוח הידרוג’לים תלת-ממדיים מאפשרת זן חד-מיני סטטי או מחזורי במהלך מיקרוסקופיה קונפוקלית חיה. מכשיר המתיחה (המכונה ‘אלונקה חד-קסיאלית מחזורית חכמה – SCyUS’) בנוי באמצעות חלקים מודפסים בתלת-ממד וחומרה בעלות נמוכה, המאפשרים רבייה קלה במעבדות אחרות. מחובר למכשיר גומי סיליקון זמין מסחרית עם חתך גיאומטרי במרכזו. רכיבי הידרוג’ל הם פולימרים כדי למלא את החיתוך. במהלך פילמור, הידרוג’לים ביולוגיים, כגון פיברין או קולגן, דבקים באופן טבעי בקירות הפנימיים של החתך. באמצעות SCyUS, רצועת הסיליקון נמתחת באופן לא סיאקסי, ומעבירה זנים מבוקרים להידרוגל 3D משובץ41.
מערכת זו מאפשרת שילוב ייחודי של תכונות ויתרונות בהשוואה לשיטות קיימות אחרות. ראשית, המערכת מאפשרת מתיחה חד-אקסיאלית של הידרוג’לים עבים של 3D (בעובי >100 מיקרומטר, נוקשות <1 kPa) מהפריפריה שלהם, עם עיוות הומוגני Zברחבי ההידרוגל. הידרוג’לים אלה רכים מכדי להיתפס ולהימתח על ידי טכניקות מתיחה קונבנציונליות. שנית, ניתן לשכפל בקלות את התקן המתיחה במעבדות אחרות מכיוון שהדפסה בתלת-ממד זמינה לחוקרים והאלקטרוניקה המשמשת בתכנון היא בעלות נמוכה. שלישית, ואולי התכונה האטרקטיבית ביותר, ניתן לתמרן בקלות את הגיאומטריה ואת גודל החיתוך ברצועת הסיליקון, מה שמאפשר מעברי מאמץ מתכווננים ותנאי גבול, כמו גם שימוש במגוון נפחי מדגם, עד כמה מיקרוליטרים.
הפרוטוקול המוצג מורכב יציקת ג’ל פיברין לתוך ~ 2 מ”מ קוטר דיסקים ב 0.5 מ”מ עבה רצועות גומי סיליקון המשיך על ידי מתיחה חד-קסיאלית תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית חיה. להלן דן בפירוט את ההליכים הניסיוניים למדידה וניתוח של הזנים הפועלים על החיתוך הגיאומטרי, הזנים הפנימיים שפותחו בהידרוגל, כמו גם יישור סיבים וכתוצאה מכך לאחר מניפולציות מתיחה שונות. לבסוף, נדון באפשרות להטמיע תאים בהידרוגל ולחשוף אותם למתיחה חיצונית מבוקרת.
השיטה והפרוטוקול המוצגים בזאת מבוססים במידה רבה על המחקר הקודם שלנו על ידי Roitblat Riba et al.41 אנו כוללים כאן את העיצוב המלא בעזרת מחשב (CAD), פייתון וקודי מיקרו-בקר של מכשיר SCyUS.
היתרונות העיקריים של השיטה המוצגת על פני גישות קיימות כוללים את האפשרות להתאמץ הידרוג’?…
The authors have nothing to disclose.
כמה מהנתונים הכלולים כאן הותאמו באישור המרכז לסיווג זכויות יוצרים: ספרינגר טבע, תולדות ההנדסה הביו-רפואית. מאמץ הידרוג’לים תלת מימדיים עם זנים אחידים של ציר z תוך מתן אפשרות להדמיה מיקרוסקופית חיה, א. רויטבלט ריבה, ס. נתן, א. קול, ה. רושקין, א. צ’ישיאן, א. לסמן, זכויות יוצרים© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20002 | |
Cell Medium (DMEM High Glucose) | Biological Industries | 01-052-1A | Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate |
Cover Slip #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22×40 mm |
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO | Sigma-Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-1A | |
EVICEL Fibrin Sealant (Human) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL |
Fibrinogen Buffer | N/A | Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2) | |
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) | Invitrogen | F8820 | Orange (540/560) Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide |
High-Temperature Silicone Rubber | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µm-thick E = 1.5 Mpa Poisson Ratio = 0.48 Tensile Strength = 4.8 MPa Upper limit of stretch = +300% engineering strain |
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | HIVAC-G 100 | |
ImageJ FIJI software39 | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) | Arduino/Adafruit | Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
MicroVL 21R Centrifuge | Thermo Scientific | 75002470 | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Primovert Light Microscope | Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systèmes | N/A | |
SCyUS Code37 | N/A | N/A | |
Servomotor – TowerPro SG-5010 | Adafruit | 155 | |
SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | For 50 mL tubes |
Sterile 10 cm non-culture plates | Corning | 430167 | |
Thrombin buffer | N/A | Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0) | |
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1B | |
USB Cable (Type B Male to Type A Male) | N/A | N/A | |
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) | Carl Zeiss AG | Release Version 14.0.0.0 |