वीवो CRISPR में/Cas9 स्क्रीनिंग एक साथ माउस त्वचा और मौखिक गुहा में जीन समारोह का मूल्यांकन करने के लिए
Summary
यहां हम एक तेजी से और प्रत्यक्ष वीवो CRISPR में वर्णन/Cas9 स्क्रीनिंग पद्धति अल्ट्रासाउंड का उपयोग कर-utero भ्रूण लेंटिवायरल इंजेक्शन में निर्देशित करने के लिए एक साथ त्वचा में कई जीन के कार्यों का आकलन और इम्यूनोसंटिम चूहों की मौखिक गुहा ।
Abstract
आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल (GEMM) जीन समारोह का आकलन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, मानव रोगों मॉडलिंग, और चिकित्सकीय रास्ते का आकलन करने के लिए पूर्व नैदानिक मॉडल के रूप में सेवारत । हालांकि, उनका समय, श्रम और लागत-प्रधान प्रकृति जीन समारोह के व्यवस्थित विश्लेषण के लिए उनकी उपयोगिता को सीमित करता है। जीनोम-संपादन प्रौद्योगिकियों में हाल की प्रगति उन सीमाओं को दूर करती है और एक मल्टीप्लेक्स और तेजी से तरीके से विशिष्ट माउस अंगों के भीतर सीधे विशिष्ट जीन क्षोभ के तेजी से उत्पादन के लिए अनुमति देती है। यहां, हम त्वचा के एपिथेलियम और चूहों के मौखिक गुहा के भीतर हजारों जीन नॉक-आउट क्लोन उत्पन्न करने के लिए एक CRISPR/Cas9-आधारित विधि (क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स) का वर्णन करते हैं, और ट्यूमर दबाने वाले जीन के लिए वीवो क्रिस्पआर स्क्रीन में प्रत्यक्ष प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक कदमों का ब्यौरा देने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह दृष्टिकोण ऊतक होरोस्टेसिस के दौरान या विभिन्न रोग सेटिंग्स में जीन के जैविक कार्य का अध्ययन करने के लिए अन्य अंगों या अन्य CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकियों जैसे CRISPR-सक्रियण या CRISPR-निष्क्रियता पर लागू किया जा सकता है ।
Introduction
जीनोमिक युग के बाद कैंसर अनुसंधान के लिए चुनौतियों में से एक कारण जीन म्यूटेशन के लिए जीनोम डेटा की विशाल मात्रा मेरा और जीन नेटवर्क है कि चिकित्सकीय लक्षित किया जा सकता है में नोड्स की पहचान करने के लिए है । जबकि जैव सूचनाओं के विश्लेषणों ने इन लक्ष्यों की दिशा में काफी मदद की है, विट्रो में कुशल और वीवो मॉडल की स्थापना जैविक प्रणालियों और रोग राज्यों की जटिलता को समझने और दवा विकास को सक्षम करने के लिए एक शर्त है । जबकि पारंपरिक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल बड़े पैमाने पर वीवो कैंसर आनुवंशिकी अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है, उनकी लागत, समय और श्रम गहन प्रकृति काफी हद तक आधुनिक जीनोमिक्स द्वारा सुलझाया ख्यात कैंसर जीन के सैकड़ों के व्यवस्थित विश्लेषण निषिद्ध है । इस अड़चन को दूर करने के लिए, हमने एक CRISPR/Cas9 (क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स) जीन संपादन प्रौद्योगिकी 3 के साथ एक साथ त्वचा में सैकड़ों जीन और एक ही माउस की मौखिक गुहा के नुकसान-समारोह म्यूटेशन को प्रेरित करने और अध्ययन करने के लिए गर्भाशय इंजेक्शन पद्धति1,2 में पहले से स्थापित अल्ट्रासाउंड-निर्देशित संयुक्त किया।
यहां वर्णित पद्धति भ्रूण दिवस E9.5 पर जीवित माउस भ्रूण के एमनियोटिक गुहा में इंजीनियर लेंटीवायरस के अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन का उपयोग करती है। CRISPR/Cas9 घटकों युक्त लेंटीवायरल कार्गो एकल स्तरित सतह ectoderm, जो बाद में त्वचा और मौखिक गुहा के epithelium को जंम देता है ट्रांसड्यूस । त्वचा एक बाहरी एपिडर्मिस से बना है, जिसके बाद बेसमेंट झिल्ली और डर्मिस होता है। एपिडर्मिस एक स्तरीकृत एपिथेलियम है जो एक आंतरिक, बेसल परत से बना होता है, जो तहखाने की झिल्ली के साथ संपर्क बनाए रखता है और इसमें प्रोलिफेरेटिव और स्टेम सेल क्षमता होती है। बेसल परत ऊपर की विभेदित परतों को जन्म देती है जैसे कि स्पिनस, दानेदार और स्ट्रैटम कॉर्नियम लेयर्स2,4. वंश ट्रेसिंग अध्ययनों से पता चलता है कि वीवो CRISPR/Cas9 विधि में यह प्रत्यक्ष आनुवंशिक रूप से बेसल परत है कि वयस्कता भर में बनी हुई है के भीतर ऊतक निवासी स्टेम कोशिकाओं में हेरफेर । चूंकि लेंटीवायरस को क्लोनल घनत्व पर E9.5 सतह ectoderm को स्थानांतरित करने के लिए टाइटेड किया जा सकता है, इस विधि का उपयोग हजारों असतत जीन नॉक आउट क्लोन को शरण देने वाले मोज़ेक चूहों को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण तो एक मल्टीप्लेक्स तरीके से उन क्लोन के भीतर CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीन ablation के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है5।
हमने हाल ही में 484 जीन के कार्य का आकलन करने के लिए इस विधि का उपयोग किया है जो मानव सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एचएनएससीसी)5में आवर्ती उत्परिवर्तन दिखाता है। एचएनएससीसी 40-50% की उच्च मृत्यु दर के साथ एक विनाशकारी कैंसर है और यहदुनियाभर में 6सबसे आम कैंसर है । एचएनएससीसी ऊपरी वायुमार्ग या मौखिक गुहा के म्यूकोसल अस्तर में उत्पन्न होता है और तंबाकू और शराब की खपत या मानव पेपिलोमावायरस (एचपीवी) संक्रमण से जुड़ा होता है। क्यूटनीस स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एससीसी) त्वचा ट्यूमर हैं और मनुष्यों में दूसरे सबसे आम कैंसर का प्रतिनिधित्व करते हैं7। क्यूपनियस एससीसी और एचएनएससीसी हिस्टोलॉजिकल और आणविक रूप से बहुत समान हैं, जिसमें टीपी53, PIK3CA, पायदान1 और एचआरएएस8में परिवर्तन प्रदर्शित करने वाले मामलों का एक उच्च प्रतिशत है। जबकि उच्च आवृत्ति पर केवल मुट्ठी भर जीन उत्परिवर्तित होते हैं, कम आवृत्ति (एंड एलटी; 5%), एक घटना आमतौर पर लंबी पूंछ वितरण के रूप में संदर्भित एक घटना पर उत्परिवर्तित पाए जाते हैं । लंबी पूंछ वाले अधिकांश जीनों में जैविक या नैदानिक सत्यापन की कमी है, इसलिए हमने ट्यूमर-प्रवण चूहों में इन जीनों के मॉडल हानि-कार्य के लिए इस का उपयोग किया, जिसमें p53, Pik3ca या Hras में संवेदीकरण को संवेदनशील बनाने के साथ और कई उपन्यास ट्यूमर दमन जीन की पहचान की गई जो ट्यूमर विकास5को ट्रिगर करने के लिए p53, Pik3ca या Hras के साथ सहयोग करते हैं।
यहां, हम मल्टीप्लेक्सेड एसजीआरएनए लेंटिवायरल CRISPR sgRNA पुस्तकालयों को उत्पन्न करने और माउस सतह ectoderm में CRISPR/Cas9 जीन नॉक आउट स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । ध्यान दें, इस पद्धति को अन्य जीन हेरफेर प्रौद्योगिकियों जैसे CRISPR सक्रियण (CRISPRa) और CRISPR निष्क्रियता (CRISPRi) को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है या जीन कार्यों का अध्ययन करने के लिए माउस में अन्य अंग प्रणालियों को लक्षित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन व्यापक रूप से इन विट्रो में और वीवो अध्ययन में जीन कार्यों और सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । वीवो अध्ययनों में अधिकांश CRISPR/Cas9 जीन संपादित कोशिकाओं का उपय?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को कनाडा के इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ रिसर्च (सीआईएचआर 365252), क्रेम्बिल फाउंडेशन और ओंटारियो रिसर्च फंड रिसर्च एक्सीलेंस राउंड 8 (आरई08-065) से एक परियोजना अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। संपत कुमार लोगनाथन कनाडा के कैंसर सोसायटी फेलोशिप (बीसी-एफ-16 #31919) के प्राप्तकर्ता हैं ।
Materials
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
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