Preparazione di cellule progenitrici adipose dai tessuti adiposi epididimali del topo
Summary
Presentiamo un metodo semplice per isolare le cellule progenitrici adipose altamente vitali dalle pastiglie di grasso epididimale del topo utilizzando lo smistamento delle cellule attivato a fluorescenza.
Abstract
L’obesità e i disturbi metabolici come diabete, malattie cardiache e cancro sono tutti associati a un drammatico rimodellamento dei tessuti adiposi. Le cellule progenitrici adipose residenti nei tessuti (APC) svolgono un ruolo chiave nell’omeostasi dei tessuti adiposi e possono contribuire alla patologia tissutale. L’uso crescente di tecnologie di analisi a singola cellula , tra cui il sequenziamento dell’RNA a singola cellula e la proteomica a singola cellula, sta trasformando il campo delle cellule staminali / progenitrici consentendo una risoluzione senza precedenti dei cambiamenti di espressione delle singole cellule nel contesto dei cambiamenti a livello di popolazione o tessuto. In questo articolo, forniamo protocolli dettagliati per sezionare il tessuto adiposo epididimale del topo, isolare le singole cellule derivate dai tessuti adiposi ed eseguire lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS) per arricchire per uno Sca1+/ CD31–/CD45–/Ter119– APC praticabile. Questi protocolli consentiranno agli investigatori di preparare APC di alta qualità adatti per analisi a valle come il sequenziamento dell’RNA a cella singola.
Introduction
Il tessuto adiposo gioca un ruolo chiave nel metabolismo energetico. L’energia in eccesso viene immagazzinata sotto forma di lipidi e il tessuto adiposo è in grado di espansione o retrazione significativa a seconda dello stato nutrizionale e della domanda energetica. L’espansione del tessuto adiposo può derivare da un aumento delle dimensioni degli adipocite (ipertrofia) e/o da un aumento del numero di adipocite (iperplasia); quest’ultimo processo strettamente regolato dalla proliferazione e differenziazione delle cellule progenitrici adipose1,2. Durante l’obesità, il tessuto adiposo si espande eccessivamente e la disfunzione tissutale – tra cui ipossia, infiammazione e resistenza all’insulina –si sviluppa spesso 3,4. Queste complicanze sono fattori di rischio per molte malattie croniche tra cui ipertensione, diabete, malattie cardiovascolari, ictus e cancro5. Pertanto, limitare l’espansione incontrollata dei tessuti adiposi e mitigare le patologie tissutali adipose sono le principali priorità di ricerca biomedica. Durante l’espansione del tessuto adiposo, le cellule staminali derivate dai tessuti adiposi residenti (ASC) proliferano e si differenziano in sequenza in preadipociti (cellule progenitrici impegnate) e quindi in adipociti maturi6. Recenti studi di sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq) mostrano che queste popolazioni di cellule progenitrici adipose (APC) (ASC e preadipociti) mostrano una sostanziale eterogeneità molecolare e funzionale7,8,9,10,11,12. Ad esempio, gli ASC mostrano una ridotta capacità di differenziazione adipogenica, ma presentano anche maggiori capacità di proliferazione ed espansione, rispetto ai preadipociti7. Ulteriori differenze molecolari sono riportate all’interno delle popolazioni ASC e preadipocite, anche se la rilevanza funzionale di queste differenze rimane poco chiara7. Insieme, questi dati evidenziano la complessità del pool di cellule progenitrici adipose e sottolineano la necessità di sviluppare e standardizzare strumenti per comprendere e manipolare meglio queste popolazioni di cellule critiche.
Questo protocollo descrive in dettaglio l’isolamento delle popolazioni di cellule progenitrici ad alta vitalità Sca1+ adipose dalle pastiglie di grasso epididimomale del topo adatte per analisi sensibili a valle, tra cui studi a cella singola (sequenziamento scRNA) e coltura cellulare. L’isolamento e la dissociazione dei cuscinetti di grasso epididimali è statoeseguito come descritto in precedenza 7,13 con lievi modifiche che migliorano la vitalità delle APC isolate. In breve, le cellule dissociate dai cuscinetti adiposi epididimali sono macchiate di anticorpi contro Sca1, un marcatore sia per gli ASC che per i preadipociti6,7e altri marcatori di lignaggio (Lin): Ter119 (cellule erythroid), CD31 (cellule endoteliali) e CD45 (leucociti). Sca1+/Ter119–/CD31–/CD45–/DAPI– le celle vengono quindi ordinate in base all’ordinamento cellulare attivato a fluorescenza (FACS). È importante sottolineare che questo protocollo è stato convalidato da un riuscito isolamento e analisi di cellule progenitrici sca1+/lin– adipose praticabili riportate in un recente studio di sequenziamento dell’RNA a singola cellula che ha identificato sottopopolazioni funzionalmente eterogenee all’interno di ASC e preadipociti7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq) sta rapidamente guadagnando trazione come un potente strumento per studiare contemporaneamente diverse popolazioni cellulari a livello di singola cellula. A causa degli elevati costi associati alla preparazione del campione e all’elevato sequenziamento della produttività, è imperativo ottimizzare gli input cellulari (alta vitalità e purezza) per aumentare la probabilità di successo sperimentale. Alcuni protocolli di preparazione cellulare si basano sulla rimozi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo la Mayo Clinic Microscopy Cell Analysis Core Flow Cytometry Facility per l’assistenza allo smistamento FACS.
Materials
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
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