Aislamiento de histone del tejido de la hoja de sorgo para la perfilación de espectrometría de masas de arriba hacia abajo de marcadores epigenéticos potenciales
Summary
El protocolo ha sido desarrollado para extraer eficazmente histonas intactas de materiales de hojas de sorgo para la elaboración de perfiles de modificaciones post-traslacionales de piedra histone que pueden servir como marcadores epigenéticos potenciales para ayudar a la ingeniería de cultivos resistentes a la sequía.
Abstract
Las histonas pertenecen a una familia de proteínas altamente conservadas en eucariotas. Empaquetan adn en nucleosomas como unidades funcionales de cromatina. Las modificaciones post-traslacionales (PTM) de histonas, que son altamente dinámicas y pueden ser añadidas o eliminadas por enzimas, desempeñan un papel crítico en la regulación de la expresión génica. En las plantas, los factores epigenéticos, incluidos los PTMs de histona, están relacionados con sus respuestas adaptativas al medio ambiente. Comprender los mecanismos moleculares del control epigenético puede traer oportunidades sin precedentes para soluciones innovadoras de bioingeniería. En este documento, describimos un protocolo para aislar los núcleos y purificar las histonas del tejido de la hoja de sorgo. Las histonas extraídas se pueden analizar en sus formas intactas mediante espectrometría de masas (EM) de arriba hacia abajo junto con cromatografía líquida en fase invertida (RP) en línea (LC). Se pueden identificar fácilmente combinaciones y estoquiometría de múltiples PTMs en el mismo proteoforme de piedra histone. Además, el recorte de cola de histona se puede detectar utilizando el flujo de trabajo LC-MS descendente, lo que produce el perfil ptm global de histonas centrales (H4, H2A, H2B, H3). Hemos aplicado este protocolo anteriormente para perfilar ptms de histona a partir de tejido de hoja de sorgo recogidos de un estudio de campo a gran escala, destinado a identificar marcadores epigenéticos de resistencia a la sequía. El protocolo podría adaptarse y optimizarse potencialmente para la inmunoprecipitación-secuenciación de cromatina (ChIP-seq), o para estudiar ptms de histona en plantas similares.
Introduction
Se espera que la creciente gravedad y frecuencia de la sequía afecte a la productividad de los cultivos de cereales1,2. El sorgo es un cultivo de alimentos y energía de cereales conocido por su excepcional capacidad para soportar condiciones de limitación de agua3,4. Estamos persiguiendo la comprensión mecanicista de la interacción entre el estrés por sequía, el desarrollo de plantas y la epigenética de las plantas de sorgo[Sorghum bicolor (L.) Moench]. Nuestro trabajo anterior ha demostrado fuertes conexiones entre el microbioma vegetal y la rizosfera en la aclimatación por sequía y las respuestas a nivel molecular5,6,7. Esta investigación allanará el camino para utilizar la ingeniería epigenética en la adaptación de los cultivos a futuros escenarios climáticos. Como parte de los esfuerzos en la comprensión de la epigenética, nuestro objetivo es estudiar marcadores proteicos que impactan la expresión génica dentro del organismo vegetal.
Las histonas pertenecen a una familia altamente conservada de proteínas en eucariotas que empaquetan el ADN en nucleosomas como unidades fundamentales de cromatina. Las modificaciones post-traslacionales (PTM) de histonas se regulan dinámicamente para controlar la estructura de la cromatina e influir en la expresión génica. Al igual que otros factores epigenéticos, incluyendo la metilación del ADN, los PTMs de histona desempeñan un papel importante en muchos procesos biológicos8,9. Los ensayos basados en anticuerpos, como las manchas occidentales, se han utilizado ampliamente para identificar y cuantificar los PTMs de histona. Además, la interacción de ptms histone y ADN puede ser sondeada eficazmente por inmunoprecipitación de cromatina – secuenciación (ChIP-seq)10. En ChIP-seq, la cromatina con PTM de histona dirigida específica se enriquece con anticuerpos contra ese PTM específico. Luego, los fragmentos de ADN se pueden liberar de la cromatina enriquecida y secuenciarse. Se revelan regiones de genes que interactúan con el PTM de histona objetivo. Sin embargo, todos estos experimentos dependen en gran medida de anticuerpos de alta calidad. Para algunas variantes/homólogos de histona o combinaciones de PTM, el desarrollo de anticuerpos robustos puede ser extremadamente difícil (especialmente para múltiples PTM). Además, los anticuerpos solo se pueden desarrollar si se conoce el PTM de piedra histone objetivo. 11 Por lo tanto, son necesarios métodos alternativos para la generación de perfiles globales notariados de PTMs de histona.
La espectrometría de masas (EM) es un método complementario para caracterizar los PTMs de histona, incluidos los PTM desconocidos para los que los anticuerpos no están disponibles11,12. El flujo de trabajo de EM “ascendente” bien establecido utiliza proteasas para digerir proteínas en péptidos pequeños antes de la separación de cromatografía líquida (LC) y la detección de EM. Debido a que las histonas tienen un gran número de residuos básicos (lisina y arginina), la digestión de la trippsina (proteasa específica para lisina y arginina) en el flujo de trabajo estándar de abajo hacia arriba corta las proteínas en péptidos muy cortos. Los péptidos cortos son técnicamente difíciles de analizar por LC-MS estándar, y no preservan la información sobre la conectividad y la estoquiometría de múltiples PTM. El uso de otras enzimas o etiquetado químico para bloquear la lisina genera péptidos más largos que son más adecuados para la caracterización de ptms de histona13,14.
Alternativamente, el paso de digestión se puede omitir por completo. En este enfoque de “arriba hacia abajo”, los iones de proteína intactos se introducen en la EM mediante ionización de electrospray (ESI) después de la separación de LC en línea, produciendo iones de los proteoformes de histona intactos. Además, los iones (es decir, proteoformes) de interés pueden aislarse y fragmentarse en el espectrómetro de masas para producir los iones de secuencia para su identificación y localización de PTM. Por lo tanto, ms de arriba hacia abajo tiene la ventaja de preservar la información de nivel proteoforme y capturar la conectividad de múltiples PTM y truncamientos de terminales en el mismo proteoforme15,16. Los experimentos de arriba hacia abajo también pueden proporcionar información cuantitativa y ofrecer información sobre biomarcadores en el nivel de proteína intacto17. En este documento, describimos un protocolo para extraer histona de la hoja de sorgo y analizar las histonas intactas por LC-MS de arriba hacia abajo.
Los datos de ejemplo mostrados en la Figura 1 y la Figura 2 provienen de la hoja de sorgo recogida en la semana 2 después de la plantación. Aunque se espera una variación del rendimiento, este protocolo es generalmente agnóstico a condiciones específicas de la muestra. El mismo protocolo se ha utilizado con éxito para el tejido de hoja vegetal de sorgo recogido de 2, 3, 5, 8, 9 y 10 semanas después de la siembra.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado describe cómo extraer histonas de muestras de hoja de sorgo (o más generalmente hoja vegetal). Se espera que el rendimiento medio de la histona sea de 2-20 μg por material de hoja de sorgo de 4-5 g. Los materiales son lo suficientemente puros para el análisis de histona aguas abajo por LC-MS (principalmente histonas con ~20% contaminación de proteína ribosomal). Se puede obtener un rendimiento menor debido a variaciones de la muestra, o posibles errores de manejo/fallas en todo el protocolo….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Ronald Moore y Thomas Fillmore por ayudar con experimentos de espectrometría masiva, y a Matthew Monroe por la deposición de datos. Esta investigación fue financiada con subvenciones del Departamento de Energía de los Estados Unidos (DOE) Investigación Biológica y Ambiental a través del proyecto epigenético control de la respuesta a la sequía en sorgo (EPICON) bajo el número de premio DE-SC0014081, del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), y a través del Joint BioEnergy Institute (JBEI), una instalación patrocinada por doe (Contrato DE-AC02-05CH11231) entre el Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley y el DOE. La investigación se realizó utilizando el Laboratorio de Ciencias Moleculares Ambientales (EMSL) (grid.436923.9), un Doe Office of Science User Facility patrocinado por la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental.
Materials
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
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