Trinvise temperaturændringer for maksimal avl og gydning i Astyanax mexicanus

Summary

Denne artikel skitserer de grundlæggende laboratoriebetingelser og protokoller for et trinvist temperaturregime for at stimulere maksimal gydning i den mexicanske tetra Astyanax mexicanus, som er en ny model for udviklingsmæssige og evolutionære undersøgelser.

Abstract

Den mexicanske tetra, Astyanax mexicanus, er et spirende modelsystem til undersøgelser i udvikling og udvikling. Eksistensen af eyed overflade (overflade fisk) og blind hule (hule fisk) morphs i denne art giver mulighed for at afhøre de mekanismer, der ligger til grund for morfologiske og adfærdsmæssige udvikling. Cave fisk har udviklet nye konstruktive og regressive træk. De konstruktive ændringer omfatter stigninger i smagsløg og kæber, lateral linje sensoriske organer, og kropsfedt. De regressive ændringer omfatter tab eller reduktion af øjne. melanin pigmentering, skolegang adfærd, aggression og søvn. For eksperimentelt at afhøre disse ændringer er det afgørende at opnå et stort antal gydede embryoner. Siden den oprindelige A. mexicanus overflade fisk og hule fisk blev indsamlet i Texas og Mexico i 1990’erne, har deres efterkommere rutinemæssigt blevet stimuleret til at opdrætte og gyde et stort antal embryoner hver anden måned i Jeffery laboratoriet. Selvom avl styres af fødevaretæthed og kvalitet, lyse mørke cyklusser og temperatur, har vi konstateret, at trinvise temperaturændringer spiller en central rolle i at stimulere maksimal gydning. Den gradvise temperaturstigning fra 72 °F til 78 °F i de første tre dage af en yngleuge giver to-tre på hinanden følgende gydedage med maksimalt antal embryoner af høj kvalitet, som derefter efterfølges af et gradvist fald i temperaturen fra 78 ° F til 72 ° F i løbet af de sidste tre dage af gydeugen. De procedurer, der er vist i denne video, skitserer arbejdsgangen før og under en laboratorieavlsuge for trinvis temperatur stimuleret gydning.

Introduction

Den teleost Astyanax mexicanus har en eyed overflade-bolig (overflade fisk) form og mange forskellige blinde hule-bolig (hule fisk) danner^1,2. Cave fisk har udviklet sig i evig mørke og under fødevarebegrænsninger, hvilket resulterer i fremkomsten af nye konstruktive og regressive træk³. De konstruktive træk omfatter stigninger i smagsløg og kæbe størrelse, sensoriske organer af lateral linje, og fedt reserver. De regressive træk omfatter tab eller reduktion af melaninpigmentering, øjne og adfærd, såsom søvn, skolegang og aggression. En egenskab ved Astyanax-systemet er fuldstændig frugtbarhed mellem de to former, hvilket gør det muligt at bruge kvantitativ egenskabs loci (QTL) kortlægning til at bestemme den eller de genomiske regioner, der er forbundet med konstruktiv og regressiv evolution^4,5,6,7. A. mexicanus tilbyder en fordelagtig system til at studere udvikling, fordi det kan induceres til at gyde ofte i laboratoriet. Embryonerne af A. mexicanus er gennemskinnelige, lidt større end zebrafisk, produceret i store mængder, og udvikler sig til seksuelt modne voksne i ca 8-12 måneder. Deres periode med maksimal gydekapacitet er omkring 5 år. Denne protokol beskriver den arbejdsgang, der er nødvendig i en A. mexicanus kulturfacilitet i løbet af en typisk avlsuge og indeholder detaljer om vedligeholdelse af fiskesystemet og temperaturkontrolregimet for maksimal gydning.

A. mexicanus er en tropisk fisk, der lever i floder med oprindelse i kalksten plateauer (overflade fisk) og i puljer i kalksten huler (hule fisk)^8. Kalksten opløses for at producere hårdt vand, og A. mexicanus trives i hårdt vand. Fisk tilpasset hårde vandforhold kan tolerere en række salte forhold, men opdrætter generelt i specifikke⁹. Induktion af gydningsadfærd opnås ved en kombination af faktorer. Fordi fisk er koldblodede og er afhængige af deres miljø for at opretholde homøostase, er deres stofskifte følsomt over for miljømæssige ændringer, og de reagerer hurtigere på stressorer¹⁰. A. mexicanus bør dyrkes i vandsystemer under omhyggeligt regulerede betingelser for vandgennemstrømning, pH, ledningsevne, osmotisk tryk, belysning og vandtemperaturer.

I Jeffery-laboratoriet opretholdes fisk i to rindende vandsystemer: (1) et “babysystem” for unge voksne fisk før seksuel modenhed og (2) et voksent (eller hoved) system til seksuelt modne, avls voksne. “Babysystemet” består af 8 L- og 15 L-tanke, der leveres med rindende vand. “Babysystemet” er seedet af yngel og unge metamorfoserede unge dyrket fra larver i mindre (1-10 L) tanke, hvor vand udveksles ugentligt. Larver, yngel og unge fugle er ekstremt fødevareafhængige og skal fodres med levende mad (saltlage rejer) en gang om dagen for at sikre en høj overlevelsesrate. Unge unge fra “babysystemet” placeres i voksensystemet efter ca. 1-1,5 år. I første omgang fodres de pulveriserede tetraflager, og efter yderligere vækst overføres de til det almindelige voksenfodringsregime. Seksuel modenhed kan vurderes ved abdominal volumen hos kvinder, og metoder til bestemmelse af køn er blevet beskrevet¹¹. I voksensystemet udskiftes vand automatisk i 42 L-tanke 3 gange pr. 24-timers periode. Voksensystemet overvåges dagligt ved visuel inspektion og automatisk temperatur, pH og ledningsevneaflæsninger fra sonder. Den optimale pH-luft er omkring 7,4 og kan ligge mellem 6,8-7,5, systemets grundtemperatur er 72/73 °F, og de ideelle ledningsevneområder mellem 600-800 mS. Automatiske aflæsninger vises på en controllerskærm, og visuel kontrol af vandtrykket aflæses ved strømningsmålere fordelt over hele systemet. Uafhængig kontrol af vandkvaliteten foretages ugentligt ved at teste temperatur og måle vandkvalitetsparametre for pH, ammoniak og nitrat ved hjælp af en kolorimetrisk test. Ammoniak- og nitratniveauet holdes på eller tæt på nul ved at tilsætte gavnlige bakterier (f.eks. Nutafin-cyklus) til systemet. Rumbelysning styres af en timer justeret til 14-timers lys og 10-timers mørke perioder. Ud over de overordnede vandkvalitetsparametre, der er nævnt ovenfor, kræver følgende overvejelser særlig opmærksomhed i løbet af en avlsuge.

Den første overvejelse er fotoperiod, da fisk (selv hulefisk i laboratoriet) er afhængige af lyscyklusser for at indstille deres døgnrytmeur. Døgnrytmen kan påvirke alt fra avl og fodring til immunsystemet sundhed^12,13 og skal være konsekvent for maksimal sundhedsmæssige fordele. Fisk opretholdes i et rindende vandsystem på en 14-timers lys og 10-timers mørk fotoperiod. Overfladefisken begynder generelt at gyde en time efter, at systemet er blevet formørket, og lys, der introduceres i denne periode, kan forstyrre og afslutte gydning. Gydningen af blinde hulefisk forstyrres mindre af lys. Sammenlignet med overfladefisk gydning, hule fisk gydning er forsinket, normalt begynder fire til fem timer efter, at systemet er blevet formørket.

Den anden overvejelse er ernæring. Voksne fisk fodres normalt med en diæt af tetraflager en gang om dagen. Før gydning fodres fisk med en proteinrig kost suppleret med ekstra mængder tetraflager og anden mad: æggeblommeflager og lejlighedsvis levende californiske blackworms (Lumbriculus sortgatus) for at kompensere for proteintab på grund af ægproduktion i den foregående gydecyklus. I yngleugen fodres fisk to gange om dagen, en gang om morgenen og igen om eftermiddagen / aftenen. Fiskefodring kun en gang om dagen, men med en enkelt meget stor del af mad bør undgås, da dette kan forårsage underernæring¹⁴.

Den tredje overvejelse er plads. Pladskravene er baseret på den gennemsnitlige kropsmasse af en voksen samt adfærdsmæssige overvejelser, såsom om fisken har skoleadfærd eller aggressiv adfærd. Over eller under-crowding tanke kan føre til øget aggression og konstant stress, hvilket gør fisk sårbare over for skade fra deres tank kammerater og tilbageholdende med at deltage i gydning¹⁵. Vi huser typisk 10-20 fisk pr. 42 L tank.

Den fjerde overvejelse er temperatur. Som nævnt ovenfor er fisk koldblodede dyr og er afhængige af miljøet for at opretholde kropstemperaturen. Fordi temperaturen har en direkte effekt på metaboliske processer, kan temperaturændringer udløse adfærdsmæssige ændringer i fisk¹⁶. Dette avlsprogram består af to ugers cyklusser i temperatur: Den første uge introducerer en temperaturstigning til 78 ° F, og den næste uge opretholder en statisk temperatur på 72 ° F. I løbet af den første (avls) uge placeres plastkantede avlsnet i bunden af tankene hver aften. Avlsnettene tjener som en barriere mellem fisken i tankene og de gydede æg, som ellers ville blive forbrugt. Temperaturen hæves med 2 °F om dagen til maksimalt 78 °F midt på ugen, og gydning induceres i henhold til lyscyklussen i de første 2-3 aftener i denne uge. Temperaturen sænkes derefter med 2 °F trin til 72 °F i løbet af de resterende dage i ugen, og basistemperaturen opretholdes indtil begyndelsen af den næste avlsuge. Avl stimuleres normalt ikke mere end to gange om måneden for at give fisken tid til at komme sig.

Samlet set giver denne metode mulighed for gydning af store mængder embryoner af højeste kvalitet over en længere periode.

Protocol

Denne procedure er blevet godkendt af Institutional Animal Care retningslinjer fra University of Maryland, College Park (I øjeblikket IACUC 469 #R-NOV-18-59; Projekt 1241065-1). Figur 1. Kalendere i løbet af en avlsuge og en ikke-avlsuge. Klik her for at se en større vers…

Representative Results

Vi opdrætter og gyder generelt efterkommere af overfladefisk, der oprindeligt blev indsamlet på Nacimiento del Rio Choy i San Luis Potosi, Mexico (Rio Choy overflade fisk) og San Solomon Springs i Balmorhea State Park, Texas (Texas overflade fisk) og hule fisk stammer fra Cueva de El Pachón (Pachón hule fisk) i Tamaulipas, Mexico, og Cueva de los Sabinos (Los Sabinos hule fisk) og Sotano de la Tinaja (Tinaja hule fisk) i San Luis Potosi Mexico. I løbet af en avlsuge indsamles data for for…

Discussion

Astyanax mexicanus er en ny biologisk model, der gyder ofte og kan opdrættes let i laboratoriet^1,2. Fordi vi er interesseret i de udviklingsmæssige mekanismer, der ligger til grund for evolutionære ændringer i A. mexicanus hulefisk, er produktion og brug af embryoner afgørende for vores forskningsmål. Hovedformålet med at opretholde en voksen bestand af fisk er produktion af embryoner og ungyngel til brug i udviklingsforsøg og til genopf…

Materials

Blackworms	Eastern Aquatics, Lancaster, PA	None
Breeding Nets	Custom made
Brine shrimp eggs	AquaCave Lake Forest, IL.	None
Colorimetric test kit	Petco	SKU:11916	API Freshwater pH Test Kit
Egg yolk flakes	Pentair, Minneapolis, MN	None
Fingerbowls	Carolina Biological Supply	741004	Culture dishes, 4.5 in, 250 mL
Hand held nets	Any Pet Store
Incubator for embryos	Fisher Scientific	51-029-321HPM	405 L
Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands, Blacksburg, VA	None
Methylene Blue	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M9140
Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20	5.75 in.
Net soaking solution	Any Pet Store
Nutrafin Cycle	Amazon	None	Bacterial boost
Refrigerator for live feed	Any source
Stereomicroscope	Any source
Thermometer	Any source
Tetra Tropical Crisps	Spectrum Brands, Blacksburg, VA	None