Summary

아스티야낙스 멕시코인의 막시달 번식과 산란에 대한 증분 온도 변화

Published: February 14, 2021
doi:

Summary

이 기사에서는 발달 및 진화 연구를 위한 새로운 모델인 멕시코 테트라 Astyanax mexicanus에서최대 산란을 자극하기 위한 증분 온도 정권에 대한 기본 실험실 조건 및 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

멕시코 테트라, Astyanax 멕시코,개발 및 진화 연구를위한 새로운 모델 시스템입니다. 이 종에서 눈 표면 (표면 물고기)과 맹목적인 동굴 (동굴 물고기)의 존재는 형태학적 및 행동 진화의 기본 메커니즘을 심문 할 수있는 기회를 제공합니다. 동굴 물고기는 새로운 건설적이고 회귀적 특성을 진화했다. 건설적인 변화는 미각과 턱의 증가, 측면 선 감각 기관 및 체지방을 포함합니다. 회귀 적 변화는 눈의 손실 또는 감소를 포함한다. 멜라닌 색소 침착, 학교 행동, 침략, 수면. 이러한 변화를 실험적으로 심문하려면 많은 수의 산란 된 배아를 얻는 것이 중요합니다. 1990년대에 텍사스와 멕시코에서 원래 A. 멕시코 어류와 동굴 물고기가 수집된 이후, 그들의 후손들은 제프리 실험실에서 격월에 많은 배아를 번식하고 생성하기 위해 정기적으로 자극을 받았습니다. 사육은 음식의 풍요로움과 품질, 밝은 어두운 주기 및 온도에 의해 제어되지만, 우리는 증분 온도 변화가 최대 산란을 자극하는 데 중요한 역할을한다는 것을 발견했습니다. 사육 주 첫 3일 동안 72°F에서 78°F로 의 온도가 점진적으로 증가하면 고품질 배아의 최대 수로 2-3일 연속 산란일을 제공하며, 그 다음에산란 주간의 마지막 3일 동안 78°F에서 72°F로 점진적으로 온도가 감소합니다. 이 비디오에 표시된 절차는 증분 온도 자극 산란에 대한 실험실 사육 주 전과 동안 워크 플로우를 설명합니다.

Introduction

텔레OST Astyanax 멕시코는 눈 표면 주거 (표면 물고기) 형태와 많은 다른 블라인드 동굴 주거 (동굴 물고기) 형성1,2. 동굴 물고기는 영원한 어둠과 음식 의 한계에서 진화, 새로운 건설적이고 회귀 특성의 출현의결과로 3. 건설적인 특성에는 미각과 턱 크기, 측면 선의 감각 기관 및 지방 매장량이 포함됩니다. 회귀적 특성에는 멜라닌 색소 침착, 눈 및 수면, 학교 및 침략과 같은 행동의 손실 또는 감소를 포함합니다. Astyanax 시스템의 특성은 두 가지 형태 사이의 완전한 다산이며, 건설적이고 회귀적인 진화4,5,6,7과관련된 게놈 영역(들)을 결정하기 위해 정량적 특성 궤적 로시(QTL) 매핑을 사용할 수 있게 한다. A. 멕시코는 실험실에서 자주 생성하도록 유도 될 수 있기 때문에 개발을 연구하는 유리한 시스템을 제공합니다. A. 멕시코인의 배아는 반투명하며, 제브라피쉬보다 약간 더 크고, 대량으로 생산되며, 약 8-12개월 동안 성적으로 성숙한 성인으로 발전합니다. 최대 산란 용량의 그들의 기간은 약 5 년입니다. 이 프로토콜은 일반적인 번식 주간 동안 A. 멕시코 문화 시설에서 필요한 워크플로우를 설명하고 물고기 시스템 유지 보수 및 최대 산란을위한 온도 제어 체제의 세부 사항을 포함합니다.

A. 멕시코는 석회암 고원 (표면 물고기)과 석회암 동굴 (동굴 물고기)의 수영장에서 유래 한 강에 사는 열대 물고기입니다8. 석회암은 용해되어 딱딱한 물을 생산하며, A. 멕시코는 단단한 물속에서 번성합니다. 경수 조건에 적응된 물고기는 다양한 짠 조건을 견딜 수 있지만 일반적으로 특정 조건에서 번식합니다9. 산란 동작의 유도는 요인의 조합에 의해 수행됩니다. 물고기는 냉혈하고 항상성을 유지하기 위해 환경에 의존하기 때문에, 그들의 신진 대사는 환경 변화에 민감하고 스트레스10에더 빨리 반응한다. A. 멕시코는 물 흐름, pH, 전도도, 삼투압, 조명 및 수온의 신중하게 규제 된 조건하에서 수중 시스템에서 배양되어야합니다.

제프리 연구소에서 생선은 성성숙 이전에 젊은 성인 생선을 위한 “아기 시스템”과 (2) 성적으로 성숙하고 번식하는 성인을 위한 성인(또는 메인) 시스템이라는 두 개의 흐르는 물 시스템에서 유지됩니다. “베이비 시스템”은 흐르는 물과 함께 제공되는 8 L 및 15 L 탱크로 구성됩니다. “아기 시스템”은 매주 물을 교환하는 작은 (1-10 L) 탱크에서 애벌레에서 자란 튀김과 젊은 변신 청소년에 의해 시드됩니다. 애벌레, 튀김 및 청소년은 매우 음식에 의존하며 높은 생존율을 보장하기 위해 하루에 한 번 살아있는 음식 (소금물 새우)을 먹여야합니다. “아기 시스템”에서 젊은 청소년은 약 1-1.5 년 후 성인 시스템에 배치됩니다. 처음에, 그들은 분쇄 테트라 플레이크를 공급하고, 추가 성장 후 그들은 일반 성인 먹이 정권으로 전송됩니다. 성적 성숙도는 여성의 복부 부피에 의해 평가될 수 있으며, 성관계를 결정하는 방법은11을설명하였습니다. 성인 시스템에서는 24시간 동안 42L 탱크에서 자동으로 물을 교환합니다. 성인 시스템은 프로브의 육안 검사 및 자동 온도, pH 및 전도도 판독값으로 매일 모니터링됩니다. 최적 pH는 약 7.4이며 6.8-7.5 사이의 범위, 시스템의 기본 온도는 72/73 °F이며, 600-800 mS 사이의 이상적인 전도도 범위. 자동 판독은 컨트롤러 화면에 표시되며, 수압의 육안 검사는 시스템 전체에 분포된 유량계에서 판독된다. 수질에 대한 독립적인 점검은 색상을 측정하여 pH, 암모니아 및 질산염에 대한 온도를 테스트하고 수질 파라미터를 측정하여 매주 이루어집니다. 암모니아와 질산염 수준은 시스템에 유익한 박테리아 (예를 들면, Nutafin 주기)를 추가하여 0에 가깝게 유지됩니다. 실내 조명은 14시간 조명과 10시간 어두운 시간대로 조정된 타이머에 의해 제어됩니다. 위에서 언급한 전체 수질 매개 변수 외에도 다음 고려 사항은 번식 주간에 특별한 주의가 필요합니다.

첫 번째 고려 사항은 물고기 (실험실의 동굴 물고기조차도)가 circadian 시계를 설정하는 빛 주기에 따라 달라지므로 포토 기간입니다. Circadian 리듬은 번식과 먹이에서 면역 체계 건강12,13에 이르기까지 모든 것에 영향을 미칠 수 있으며 최대의 건강 상의 이점을 위해 일관성이 있어야합니다. 물고기는 14시간 빛과 10시간 어두운 광도에 흐르는 물 시스템에서 유지됩니다. 표면 물고기는 일반적으로 시스템이 어두워진 후 한 시간 후에 산란하기 시작하고,이 기간 동안 도입 된 빛은 산란을 방해하고 종료 할 수 있습니다. 맹목적인 동굴 물고기의 산란은 빛에 의해 덜 방해된다. 표면 물고기 산란에 비해, 동굴 물고기 산란은 일반적으로 시스템이 어두워진 후 4 ~ 5 시간 시작, 지연된다.

두 번째 고려 사항은 영양입니다. 성인 생선은 일반적으로 하루에 한 번 테트라 플레이크의 다이어트를 공급한다. 산란하기 전에, 생선은 테트라 플레이크와 다른 음식의 여분의 양으로 보충 단백질이 풍부한 다이어트를 공급한다 : 계란 노른자 플레이크와 때때로 살아 캘리포니아 흑벌레(Lumbriculus variegatus)이전 산란 주기 동안 계란 생산으로 인한 단백질 손실을 보상하기 위해. 번식 주간에는 하루에 두 번, 아침에 한 번, 오후/저녁에 다시 먹이를 주게 됩니다. 하루에 한 번만 먹이를 주는 물고기이지만 영양실조14를유발할 수 있으므로 매우 많은 양의 음식을 피해야 합니다.

세 번째 고려 사항은 공간입니다. 공간 요구 사항은 물고기가 학교 행동이나 공격적인 행동을 가지고 있는지 여부와 같은 행동 고려 사항뿐만 아니라 성인의 평균 신체 질량을 기반으로합니다. 오버 또는 언더 크라우드 탱크는 고조 된 침략과 지속적인 스트레스로 이어질 수 있습니다, 물고기는 탱크 동료에서 부상에 취약하고 산란에 참여하는 것을꺼려15. 우리는 일반적으로 42 L 탱크 당 10-20 물고기를 수용합니다.

네 번째 고려 사항은 온도입니다. 위에서 언급 했듯이, 물고기는 냉혈한 동물이며 체온을 유지하기 위해 환경에 의존합니다. 온도는 신진 대사 과정에 직접적인 영향을 미치기 때문에 온도의 변화는 물고기16의행동 변화를 유발할 수 있습니다. 이 번식 프로그램은 온도에서 2 주 주기로 구성되어 있습니다 : 첫 주에는 78 °F의 온도 스파이크를 도입하고 다음 주에는 72 ° F의 정적 온도를 유지합니다. 첫 번째 (번식) 주 동안, 플라스틱 가장자리 사육 그물은 매일 저녁 탱크의 바닥에 배치됩니다. 번식 그물은 탱크의 물고기와 산란 된 계란 사이의 장벽 역할을하며, 그렇지 않으면 소비 될 것입니다. 기온은 주중반까지 하루 2°F에서 최대 78°F까지 상승하며, 이번 주 첫 2-3저녁에 광사이클에 따라 산란이 유도된다. 그 후 남은 주 동안 온도가 2°F 증분하여 72°F로 낮아지고, 기초 온도는 다음 번식주의 시작까지 유지된다. 번식은 일반적으로 물고기 시간이 회복 할 수 있도록 한 달에 두 번 이상 자극되지 않습니다.

전반적으로, 이 방법은 더 긴 기간 동안 최고 품질의 배아의 대량의 산란을 허용합니다.

Protocol

이 절차는 메릴랜드 대학, 대학 공원의 기관 동물 관리 지침에 의해 승인되었습니다 (현재 IACUC 469 #R-NOV-18-59; 프로젝트 1241065-1). 그림 1. 번식 주간과 비 번식 주간 달력. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 ?…

Representative Results

우리는 일반적으로 산 루이스 포토시의 나키미엔토 델 리오 초이에서 원래 수집 된 표면 물고기의 후손을 번식하고 산란합니다. 멕시코(리오 초이 표면 물고기)와 텍사스 주 발모헤아 주립공원의 샌 솔로몬 스프링스와 멕시코 타마울리파스, 쿠에바 데 로스 사비노스(로스 사비노스 동굴 물고기) 및 소타노 데 라 티나야(티나야 동굴 물고기)에서 추출한 동굴 물고기 멕시코. 사…

Discussion

아스티아나엑스멕시카누스는 자주 생성되어 실험실1,2에서쉽게 사육할 수 있는 새로운 생물학적 모델이다. 우리는 A. 멕시코 동굴 물고기의 진화적 변화를 뒷받침하는 발달 메커니즘에 관심이 있기 때문에 배아의 생산과 사용은 연구 목표에 매우 중요합니다. 물고기의 성인 재고를 유지하는 주요 목적은 발달 실험에 사용 및 성인 사육 주?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

데이비드 마르타시안, 디드레 헤이저, 에이미 파크허스트, 크레이그 푸트, 맨디 응에게 제프리 연구소 A. 멕시코 문화 시설에 귀중한 공헌을 해 주셔서 감사합니다. 제프리 연구소의 연구는 현재 NIH 보조금 EY024941에 의해 지원됩니다.

Materials

Blackworms Eastern Aquatics, Lancaster, PA None
Breeding Nets Custom made
Brine shrimp eggs AquaCave Lake Forest, IL. None
Colorimetric test kit Petco SKU:11916 API Freshwater pH Test Kit
Egg yolk flakes Pentair, Minneapolis, MN None
Fingerbowls Carolina Biological Supply 741004 Culture dishes, 4.5 in, 250 mL
Hand held nets Any Pet Store
Incubator for embryos Fisher Scientific 51-029-321HPM 405 L
Instant Ocean sea salts Spectrum Brands, Blacksburg, VA None
Methylene Blue Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M9140
Pasteur Pipettes Fisher Scientific 13-678-20 5.75 in.
Net soaking solution Any Pet Store
Nutrafin Cycle Amazon None Bacterial boost
Refrigerator for live feed Any source
Stereomicroscope Any source
Thermometer Any source
Tetra Tropical Crisps Spectrum Brands, Blacksburg, VA None

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Cite This Article
Ma, L., Dessiatoun, R., Shi, J., Jeffery, W. R. Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus. J. Vis. Exp. (168), e61708, doi:10.3791/61708 (2021).

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