अस्टायनेक्स में अधिकतम प्रजनन और स्पॉनिंग के लिए वृद्धिशील तापमान परिवर्तन
Summary
यह लेख मैक्सिकन टेट्रा अस्टायनक्स मेक्सिकनसमें अधिकतम स्पॉन को प्रोत्साहित करने के लिए एक वृद्धिशील तापमान शासन के लिए बुनियादी प्रयोगशाला स्थितियों और प्रोटोकॉल को रेखांकित करता है, जो विकासात्मक और विकासवादी अध्ययनों के लिए एक उभरता हुआ मॉडल है।
Abstract
मैक्सिकन टेट्रा, Astyanax मैक्सिकनस,विकास और विकास में अध्ययन के लिए एक उभरती हुई मॉडल प्रणाली है। इस प्रजाति में आंखों की सतह (सतह मछली) और अंधी गुफा (गुफा मछली) रूपों का अस्तित्व रूपात्मक और व्यवहार विकास अंतर्निहित तंत्र से पूछताछ करने का अवसर प्रस्तुत करता है। गुफा मछली ने उपन्यास रचनात्मक और प्रतिगामी लक्षण विकसित किए हैं। रचनात्मक परिवर्तनों में स्वाद कलियों और जबड़े, पार्श्व रेखा संवेदी अंगों और शरीर की वसा में वृद्धि शामिल है। प्रतिगामी परिवर्तनों में आंखों का नुकसान या कमी शामिल है। मेलानिन पिगमेंटेशन, स्कूली शिक्षा व्यवहार, आक्रामकता, और नींद। प्रायोगिक रूप से इन परिवर्तनों से पूछताछ करने के लिए, बड़ी संख्या में पैदा किए गए भ्रूण प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। चूंकि मूल ए मैक्सिकनस सतह मछली और गुफा मछली 1990 के दशक में टेक्सास और मेक्सिको में एकत्र किए गए थे, उनके वंशजों को नियमित रूप से जैफरी प्रयोगशाला में बड़ी संख्या में भ्रूण को नस्ल और अंडे देने के लिए प्रेरित किया गया है। हालांकि प्रजनन खाद्य बहुतायत और गुणवत्ता, प्रकाश अंधेरे चक्र, और तापमान द्वारा नियंत्रित किया जाता है, हमने पाया है कि वृद्धिशील तापमान परिवर्तन अधिकतम अंडे उत्तेजक में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । प्रजनन सप्ताह के पहले तीन दिनों में तापमान की क्रमिक वृद्धि 72 डिग्री एफ से 78 डिग्री एफ हो जाती है, जो उच्च गुणवत्ता वाले भ्रूणों की अधिकतम संख्या के साथ लगातार दो-तीन स्पॉन दिन प्रदान करता है, जिसके बाद स्पॉन सप्ताह के अंतिम तीन दिनों के दौरान तापमान में 78 डिग्री एफ से 72 डिग्री एफ तक धीरे-धीरे कमी आती है। इस वीडियो में दिखाई गई प्रक्रियाएं वृद्धिशील तापमान उत्तेजित स्पॉन के लिए प्रयोगशाला प्रजनन सप्ताह से पहले और उसके दौरान कार्यप्रवाह की रूपरेखा तैयार करती हैं।
Introduction
टेलीस्ट अस्टायनेक्स मैक्सिकनस में एक आंखों वाली सतह-निवास (सतह मछली) रूप है और कई अलग-अलग अंधे गुफा में रहने वाले (गुफा मछली) रूप1,2हैं। गुफा मछली सदा अंधेरे में और खाद्य सीमाओं के तहत विकसित हुई है, जिसके परिणामस्वरूप उपन्यास रचनात्मक और प्रतिगामी लक्षण3की उपस्थिति हुई है। रचनात्मक लक्षण स्वाद कलियों और जबड़े के आकार, पार्श्व रेखा के संवेदी अंगों, और वसा भंडार में वृद्धि शामिल हैं । प्रतिगामी लक्षणों में मेलेनिन पिगमेंटेशन, आंखों और व्यवहारों में कमी या कमी शामिल है, जैसे नींद, स्कूली शिक्षा और आक्रामकता। अस्टायनेक्स प्रणाली का एक गुण दोनों रूपों के बीच पूर्ण प्रजनन क्षमता है, जिससे रचनात्मक और प्रतिगामी विकास 4,5,6,7से जुड़े जीनोमिक क्षेत्र(एस)को निर्धारित करने के लिए मात्रात्मक विशेषता लोकी (क्यूटीएल) मैपिंग का उपयोग करने की अनुमति है। ए मैक्सिकनस विकास का अध्ययन करने के लिए एक लाभप्रद प्रणाली प्रदान करता है क्योंकि इसे प्रयोगशाला में अक्सर अंडे देने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। ए मैक्सिकनस के भ्रूण पारदर्शी होते हैं, जो बड़ी मात्रा में उत्पादित जेब्राफिश की तुलना में थोड़ा बड़े होते हैं, और लगभग 8-12 महीनों में यौन परिपक्व वयस्कों में विकसित होते हैं। उनकी अधिकतम स्पॉन क्षमता की अवधि लगभग 5 वर्ष है। यह प्रोटोकॉल एक विशिष्ट प्रजनन सप्ताह के दौरान ए मैक्सिकन संस्कृति सुविधा में आवश्यक कार्यप्रवाह का वर्णन करता है और इसमें मछली प्रणाली के रखरखाव और अधिकतम स्पॉन के लिए तापमान नियंत्रण व्यवस्था का विवरण शामिल है।
ए मैक्सिकनस एक उष्णकटिबंधीय मछली है जो चूना पत्थर के पठारों (सतह मछली) में और चूना पत्थर की गुफाओं (गुफा मछली)8में पूल में उत्पन्न नदियों में रहती है। चूना पत्थर कठिन पानी का उत्पादन करने के लिए घुल जाता है, और ए मैक्सिकनस कठिन पानी में पनपती है । कठिन पानी की स्थिति के अनुकूल मछली नमकीन स्थितियों की एक श्रृंखला बर्दाश्त कर सकते हैं, लेकिन आम तौर पर विशिष्ट लोगों में नस्ल9। स्पॉनिंग व्यवहार का प्रेरण कारकों के संयोजन से पूरा किया जाता है। क्योंकि मछली ठंडे खून वाले होते हैं और होमोसेस्टेसिस को बनाए रखने के लिए अपने पर्यावरण पर भरोसा करते हैं, इसलिए उनका चयापचय पर्यावरणीय परिवर्तनों के प्रति संवेदनशील होता है और वे10तनाव ों पर अधिक तेजी से प्रतिक्रिया करते हैं। A. मेक्सिकन को जलीय प्रणालियों में पानी के प्रवाह, पीएच, चालकता, ऑस्मोटिक दबाव, प्रकाश व्यवस्था और पानी के तापमान की सावधानीपूर्वक विनियमित स्थितियों के तहत सुसंस्कृत किया जाना चाहिए।
जैफरी प्रयोगशाला में, मछली को दो रनिंग वॉटर सिस्टम में बनाए रखा जाता है: (1) यौन परिपक्वता से पहले युवा वयस्क मछली के लिए एक “बेबी सिस्टम” और (2) यौन परिपक्व, प्रजनन वयस्कों के लिए एक वयस्क (या मुख्य) प्रणाली। “बेबी सिस्टम” में 8 एल और 15 एल टैंक होते हैं जो चलने वाले पानी के साथ आपूर्ति करते हैं। “बेबी सिस्टम” को छोटे (1-10 एल) टैंकों में लार्वा से उगाए गए फ्राई और युवा कायापलट किशोरों द्वारा वरीयता प्राप्त है, जिसमें पानी का आदान-प्रदान साप्ताहिक किया जाता है। लार्वा, फ्राई और किशोर बेहद भोजन पर निर्भर हैं और जीवित रहने की उच्च दर सुनिश्चित करने के लिए दिन में एक बार लाइव भोजन (नमकीन झींगा) खिलाया जाना चाहिए। “बेबी सिस्टम” से युवा किशोरों के बारे में 1-1.5 साल के बाद वयस्क प्रणाली में रखा जाता है । सबसे पहले, उन्हें स्प्वेराइज्ड टेट्रा फ्लेक्स खिलाया जाता है, और आगे की वृद्धि के बाद उन्हें नियमित वयस्क भोजन शासन में स्थानांतरित कर दिया जाता है। यौन परिपक्वता का आकलन महिलाओं में पेट की मात्रा द्वारा किया जा सकता है, और सेक्स का निर्धारण करने के तरीकों को11वर्णित किया गया है। वयस्क प्रणाली में, 24 घंटे की अवधि के अनुसार 42 एल टैंकों में पानी का आदान-प्रदान स्वचालित रूप से 3 बार किया जाता है। वयस्क प्रणाली दृश्य निरीक्षण और स्वचालित तापमान, पीएच, और जांच से चालकता रीडिंग द्वारा दैनिक निगरानी की जाती है। इष्टतम पीएच 7.4 के आसपास है और 6.8-7.5 के बीच हो सकता है, सिस्टम का आधार तापमान 72/73 डिग्री एफ है, और आदर्श चालकता 600-800 एमएस के बीच होती है। स्वचालित रीडिंग एक नियंत्रक स्क्रीन पर प्रदर्शित की जाती है, और पूरे सिस्टम में वितरित पानी के दबाव की दृश्य जांच पढ़ी जाती है। पानी की गुणवत्ता पर स्वतंत्र जांच तापमान का परीक्षण और पीएच, अमोनिया, और नाइट्रेट के लिए पानी की गुणवत्ता मापदंडों को मापने के द्वारा साप्ताहिक किया जाता है एक कोलोरिमेट्रिक परीक्षण का उपयोग कर । अमोनिया और नाइट्रेट के स्तर को सिस्टम में लाभकारी बैक्टीरिया (जैसे, न्यूटिन चक्र) जोड़कर शून्य के करीब रखा जाता है। कमरे की रोशनी को 14 घंटे की रोशनी और 10 घंटे के अंधेरे समय में समायोजित टाइमर द्वारा नियंत्रित किया जाता है। ऊपर उल्लिखित समग्र जल गुणवत्ता मापदंडों के अलावा, प्रजनन सप्ताह के दौरान निम्नलिखित विचारों पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है।
पहला विचार फोटोपीरियोड है, क्योंकि मछली (प्रयोगशाला में गुफा मछली) अपनी सर्कैडियन घड़ी स्थापित करने के लिए प्रकाश चक्रों पर निर्भर करती है। सर्कैडियन लय प्रजनन और भोजन से प्रतिरक्षा प्रणाली स्वास्थ्य12,13 तक सब कुछ प्रभावित कर सकते हैं और अधिकतम स्वास्थ्य लाभों के अनुरूप होना चाहिए। मछली को 14 घंटे की रोशनी और 10 घंटे डार्क फोटोपीरिड पर रनिंग-वॉटर सिस्टम में बनाए रखा जाता है । सतह मछली आम तौर पर एक घंटे के बाद सिस्टम अंधेरा हो गया है पैदा शुरू, और इस अवधि के दौरान शुरू की प्रकाश के साथ हस्तक्षेप और अंडे समाप्त कर सकते हैं । अंधी गुफा मछली के स्पॉन प्रकाश से कम परेशान होते हैं। सतह मछली पैदा करने की तुलना में, गुफा मछली पैदा करने में देरी हो रही है, आमतौर पर चार से पांच घंटे के बाद प्रणाली अंधेरा हो गया है शुरू ।
दूसरा विचार पोषण है। वयस्क मछली को आम तौर पर दिन में एक बार टेट्रा गुच्छे का आहार खिलाया जाता है। स्पॉनिंग से पहले, मछली को प्रोटीन युक्त आहार खिलाया जाता है जो टेट्रा गुच्छे और अन्य भोजन की अतिरिक्त मात्रा के साथ पूरक होता है: अंडे की जर्दी के गुच्छे और कभी-कभी कैलिफोर्निया ब्लैकवार्म(लुब्रिकुलस वेरगेटस)रहते हैं जो पिछले स्पॉनिंग चक्र के दौरान अंडे के उत्पादन के कारण प्रोटीन हानि की भरपाई करते हैं। प्रजनन सप्ताह के दौरान, मछली को प्रति दिन दो बार खिलाया जाता है, एक बार सुबह और फिर दोपहर/शाम में । दिन में केवल एक बार मछली खिलाने लेकिन भोजन के एक बहुत बड़े हिस्से के साथ बचा जाना चाहिए, क्योंकि इससे कुपोषण14हो सकता है ।
तीसरा विचार अंतरिक्ष है । अंतरिक्ष आवश्यकताओं को एक वयस्क के औसत शरीर द्रव्यमान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से व्यवहार विचार, जैसे कि मछली स्कूली शिक्षा व्यवहार या आक्रामक व्यवहार है पर आधारित हैं । अधिक या कम भीड़ टैंक बढ़ आक्रामकता और लगातार तनाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, मछली अपने टैंक साथियों से चोट के लिए असुरक्षित बनाने और15अंडे में भाग लेने के लिए अनिच्छुक । हम आम तौर पर 42 एल टैंक प्रति 10-20 मछली घर।
चौथा विचार तापमान है। जैसा कि ऊपर बताया गया है, मछली ठंडे खून वाले जानवर हैं और शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए पर्यावरण पर भरोसा करते हैं। क्योंकि तापमान मेटाबोलिक प्रक्रियाओं पर सीधा प्रभाव पड़ता है, तापमान में परिवर्तन मछली16में व्यवहार परिवर्तन को ट्रिगर कर सकते हैं । इस प्रजनन कार्यक्रम में तापमान में दो सप्ताह के चक्र होते हैं: पहले सप्ताह 78 डिग्री एफ के लिए एक तापमान स्पाइक का परिचय देता है, और अगले सप्ताह 72 डिग्री एफ के स्थिर तापमान को बनाए रखता है। पहले (प्रजनन) सप्ताह के दौरान, प्लास्टिक धार प्रजनन जाल हर शाम टैंकों के तल पर रखा जाता है । प्रजनन जाल टैंकों और अंडे में मछली के बीच एक बाधा के रूप में काम करते हैं, जो अन्यथा भस्म हो जाएगा। तापमान प्रति दिन 2 डिग्री एफ से मध्य सप्ताह तक अधिकतम 78 डिग्री एफ तक बढ़ाया जाता है, और इस सप्ताह की पहली 2-3 शाम में प्रकाश चक्र के अनुसार स्पॉन को प्रेरित किया जाता है। तब तापमान सप्ताह के शेष दिनों के दौरान 2 डिग्री एफ वेतन वृद्धि से 72 डिग्री एफ तक कम हो जाता है, और अगले प्रजनन सप्ताह की शुरुआत तक आधार तापमान बनाए रखा जाता है। प्रजनन आमतौर पर मछली के समय को ठीक करने की अनुमति देने के लिए महीने में दो बार से अधिक नहीं प्रेरित किया जाता है।
कुल मिलाकर, यह विधि लंबे समय तक उच्चतम गुणवत्ता वाले भ्रूणों की बड़ी मात्रा में पैदा करने की अनुमति देती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अस्टायनेक्स मेक्सिकनस एक उपन्यास जैविक मॉडल है जो अक्सर पैदा होता है और प्रयोगशाला में आसानी से पैदा किया जा सकता है1,2. क्योंकि हम विकास तंत्र है कि ए मैक्सिकन गुफा मछली मे?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डेविड मार्टासियन, डेड्रे हेसर, एमी पार्कहर्स्ट, क्रेग फुटे और मैंडी एनजी को जेफरी प्रयोगशाला ए मैक्सिकनस संस्कृति सुविधा में मूल्यवान योगदान के लिए धन्यवाद देते हैं। जैफरी प्रयोगशाला में अनुसंधान वर्तमान में NIH अनुदान EY024941 द्वारा समर्थित है।
Materials
| Blackworms | Eastern Aquatics, Lancaster, PA | None | |
| Breeding Nets | Custom made | ||
| Brine shrimp eggs | AquaCave Lake Forest, IL. | None | |
| Colorimetric test kit | Petco | SKU:11916 | API Freshwater pH Test Kit |
| Egg yolk flakes | Pentair, Minneapolis, MN | None | |
| Fingerbowls | Carolina Biological Supply | 741004 | Culture dishes, 4.5 in, 250 mL |
| Hand held nets | Any Pet Store | ||
| Incubator for embryos | Fisher Scientific | 51-029-321HPM | 405 L |
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M9140 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20 | 5.75 in. |
| Net soaking solution | Any Pet Store | ||
| Nutrafin Cycle | Amazon | None | Bacterial boost |
| Refrigerator for live feed | Any source | ||
| Stereomicroscope | Any source | ||
| Thermometer | Any source | ||
| Tetra Tropical Crisps | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None |
References
- Jeffery, W. R. Cavefish as a model system in evolutionary developmental biology. Developmental Biology. 231, 1-12 (2001).
- Jeffery, W. R. Emerging model systems in evo-devo: cavefish and mechanisms of microevolution. Evolution & Development. 10, 265-272 (2008).
- Jeffery, W. R. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C. J., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17, 452-454 (2007).
- O’Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish. PLoS ONE. 8 (2), 57281 (2013).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, 15 (2015).
- Elliot, W. R. The Astyanax caves of Mexico. Cavefishes of Tamaulipas, San Luis Potosi, and Guerrero. Association for Mexican Cave Studies Bulletin. 26, 1 (2018).
- Luo, S., Wu, B., Xiong, X., Wang, J. Effects of total hardness and calcium:magnesium ratio of water during early stages of rare minnows (Gobiocypris rarus). Comparative Medicine. 66, 181-187 (2016).
- Balasch, J. C., Tort, L. Netting the stress responses in fish. Frontiers in Endocrinology. 10, 62 (2019).
- Borowsky, R. . Determining the sex of adult Astyanax mexicanus. , (2008).
- Paschos, G. Circadian clocks, feeding time, and metabolic homeostasis. Frontiers in Pharmacology. 6, 112 (2015).
- Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nature Reviews Immunology. 13, 190-198 (2013).
- Williams, M. B., Watts, S. A. Current basis and future directions of zebrafish nutrigenomics. Genes & Nutrition. 14, 34 (2009).
- Harper, C., Wolf, J. C. Morphologic effects of the stress response in fish. ILAR Journal. 50, 387-396 (2009).
- Neubauer, P., Andersen, K. H. Thermal performance in fish is explained by an interplay between physiology, behavior and ecology. Conservation Physiology. 7 (1), 025 (2019).
- Hinaux, H., et al. Developmental staging table for Astyanax mexicanus. Zebrafish. 8 (4), (2011).
- Borowsky, R. . In vitro fertilization of Astyanax mexicanus. , (2008).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Rétaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), 0212591 (2019).
- Harvey, B. J., Carolsfield, J. Induced Breeding in Tropical Fish Culture. International Development Research Centre. , (1993).
- Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. The role of a lens survival pathway including sox2 and aA-crystallin in the evolution of cavefish eye degeneration. EvoDevo. 5, 28 (2014).
- Krishnan, J., Rohner, N. Cavefish and the basis for eye loss. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 5 (372), 20150487 (2017).
- Bilandžija, H., Abraham, L., Ma, L., Renner, K., Jeffery, W. R. Behavioral changes controlled by catecholaminergic systems explain recurrent loss of pigmentation in cavefish. Proceedings of the Royal Society. 285, (2018).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish. PLoS ONE. 1093, 0119370 (2015).
- Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441, 313-318 (2018).
